Второе пришествие генной терапии. Генная терапия Генная терапия ex vivo и in vivo

Генная терапия – одна из стремительно развивающихся областей медицины, которая предполагает лечение человека посредством введения в организм здоровых генов. Причем, как утверждают ученые, с помощью генной терапии можно добавить недостающий ген, исправить или заменить его, улучшив тем самым работу организма на клеточном уровне и нормализовав состояние больного.

По словам ученых, потенциальными кандидатами для генной терапии на сегодняшний день являются 200 млн. жителей планеты, причем эта цифра неуклонно растет. И очень отрадно, что несколько тысяч пациентов уже получили лечение от неизлечимых недугов в рамках проводимых испытаний.

В данной статье расскажем о том, какие задачи ставит перед собой генная терапия, какие заболевания можно лечить этим методом и с какими проблемами приходится сталкиваться ученым.

Где применяется генотерапия

Изначально генная терапия была задумана для борьбы с тяжелыми наследственными заболеваниями, такими как болезнь Хантингтона, муковисцидоз (кистозный фиброз) и некоторыми инфекционными заражениями. Однако 1990-й год, когда ученым удалось скорректировать дефектный ген, и, введя его в организм больного, победить муковисцидоз, стал поистине революционным в области генной терапии. Миллионы людей во всем мире получили надежду на лечение заболеваний, которые прежде считались неизлечимыми. И пусть такая терапия находится у самых истоков развития, ее потенциал вызывает удивление даже в научном мире.

Так, например, кроме кистозного фиброза, современные ученые добились успехов борьбе с такими наследственными патологиями, как гемофилия, энзимопатия и иммунодефицит. Более того, лечение генами позволяет бороться с некоторыми онкологическими заболеваниями, а также с патологиями сердца, болезнями нервной системы и даже травмами, к примеру, с повреждениями нервов. Таким образом, генная терапия занимается заболеваниями с крайне тяжелым протеканием, которые приводят к ранней смертности и, зачастую, не имеют другого лечения, кроме терапии генами.

Принцип лечения генами

В качестве действующего вещества врачи используют генетическую информацию, а если быть точным, молекулы, которые являются носителями такой информации. Реже для этого применяют нуклеиновые кислоты РНК, а чаще – клетки ДНК.

Каждая такая клетка обладает так называемым «ксероксом» – механизмом, при помощи которого она переводит генетическую информацию в белки. Клетка, у которой имеется правильный ген и без сбоев работает «ксерокс», с точки зрения генной терапии является здоровой клеткой. У каждой здоровой клетки имеется целая библиотека оригинальных генов, которые она использует для правильной и слаженной работы всего организма. Однако если по какой-либо причине важный ген утерян, восстановить такую потерю не представляется возможным.

Это становится причиной развития серьезных генетических заболеваний, таких как миодистрофия Дюшена (при ней у больного прогрессирует мышечный паралич, и он в большинстве случаев не доживает до 30 лет, умирая от остановки дыхания). Или менее фатальная ситуация. К примеру, «поломка» определенного гена приводит к тому, что белок перестает выполнять свои функции. И это становится причиной развития гемофилии.

В любом из перечисленных случаев на помощь приходит генная терапия, задачей которой является доставить нормальную копию гена в больную клетку и подложить в её в клеточный «ксерокс». В этом случае наладится работа клетки, а может быть, восстановится функционирование всего организма, благодаря чему человек избавится от тяжелого недуга и сможет продлить свою жизнь.

Какие болезни лечит генная терапия

Насколько реально помогает человеку генная терапия? По подсчетам ученых, в мире насчитывается около 4200 заболеваний, которые возникают в результате неправильной работы генов. В этом плане потенциал у данного направления медицины просто невероятный. Однако гораздо важнее то, чего на сегодняшний день удалось добиться медикам. Безусловно, на этом пути хватает трудностей, однако уже сегодня можно выделить ряд локальных побед.

К примеру, современные ученые разрабатывают подходы к лечению ишемической болезни сердца посредством генов. А ведь это невероятно распространенное заболевание, которое поражает гораздо больше людей, чем врожденные патологии. В конечном итоге, человек, столкнувшийся с ишемической болезнью, оказывается в таком состоянии, когда единственным спасением для него может стать генная терапия.

Более того, на сегодняшний день при помощи генов лечатся патологии, связанные с поражением центральной нервной системы. Это такие заболевания, как боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона. Что интересно, для лечения перечисленных недугов используются вирусы, которые имеют свойство атаковать нервную систему. Так, при помощи вируса герпеса в нервную систему доставляют цитокины и факторы роста, замедляющие развитие заболевания. Это яркий пример того, как патогенный вирус, который обычно вызывает болезнь, обрабатывается в лабораторных условиях, лишаясь белков, несущих заболевание, и используется как кассета, которая доставляет в нервы целебные вещества и тем самым действует во благо здоровья, продлевая жизнь человека.

Еще одним тяжелым наследственным заболеванием является холестеринемия, которая приводит организм человека к неспособности регулировать холестерин, вследствие чего в его организме скапливаются жиры, и возрастает риск инфарктов и инсультов. Чтобы справиться с этой проблемой, специалисты удаляют больному часть печени и исправляют поврежденный ген, останавливая дальнейшее накопление холестерина организмом. После этого исправленный ген помещают в обезвреженный вирус гепатита, и с его помощью отправляют обратно в печень.

Читайте также:

Имеются положительные подвижки и в борьбе со СПИДом. Не секрет ведь, что СПИД вызывается вирусом иммунодефицита человека, который разрушает иммунную систему и открывает ворота к организму смертельно опасным заболеваниям. Современные ученые уже знают, каким образом изменить гены, чтобы они перестали ослаблять иммунную систему, а начали укреплять ее для противодействия вирусу. Такие гены вводятся через кровь, посредством ее переливания.

Работает генная терапия и против раковых заболеваний, в частности, против рака кожи (меланомы). Лечение таких пациентов предполагает введение генов с факторами некроза опухоли, т.е. генов, которые содержат противоопухолевый белок. Более того, сегодня проводятся испытания по лечению рака мозга, где больным пациентам вводят ген, содержащий информацию по увеличению чувствительности злокачественных клеток к применяемым препаратам.

Болезнь Гоше представляет собой тяжелейшее наследственное заболевание, которое вызывается мутацией гена, подавляющего производство особого фермента – глюкоцереброзидазы. У лиц, страдающих от этого неизлечимого недуга, увеличена селезенка и печень, а с прогрессированием недуга начинают разрушаться кости. Ученым уже сегодня удались опыты по введению в организм таких пациентов гена, содержащего информацию по выработке данного фермента.

А вот еще один пример. Не секрет, что ослепший человек на всю оставшуюся жизнь лишается возможности воспринимать зрительные образы. Одной из причин врожденной слепоты считается так называемая атрофия Лебера, которая, по сути, является генной мутацией. На сегодняшний день ученые вернули 80 слепым людям зрительные способности, посредством модифицированного аденовируса, который доставил «рабочий» ген в ткани глаза. К слову, несколько лет назад ученым удалось вылечить дальтонизм у подопытных обезьян, путем внедрения в сетчатку глаза животного здорового человеческого гена. А совсем недавно такая операция позволила вылечить дальтонизм первым пациентам.

Что характерно, метод доставки генной информации при помощи вирусов является самым оптимальным, так как вирусы сами находят свои цели в организме (вирус герпеса обязательно найдет нейроны, а вирус гепатита – печень). Однако у данного метода доставки генов есть существенный недостаток – вирусы иммуногены, а значит, при попадании в организм могут быть уничтожены иммунитетом до того, как успеют сработать, а то и вызовут мощные иммунные ответы организма, лишь ухудшив состояние здоровья.

Существует и другой способ доставки генного материала. Это кольцевая молекула ДНК или плазмида. Она отлично спирализуется, становясь очень компактной, что позволяет ученым «упаковать» ее в химический полимер и внедрить в клетку. В отличие от вируса, плазмида не вызывает иммунной реакции организма. Однако этот способ менее подходящий, т.к. спустя 14 дней плазмида удаляется из клетки и продукция белка останавливается. То есть, таким способом ген необходимо вводить на протяжении длительного времени, пока клетка будет «выздоравливать».

Таким образом, у современных ученых есть два мощных метода доставки генов к «больным» клеткам, причем использование вирусов выглядит более предпочтительным. В любом случае окончательное решение по выбору того или иного метода выбирает врач, исходя из реакции организма пациента.

Проблемы, с которыми сталкивается генотерапия

Можно сделать определенный вывод о том, что генная терапия – малоизученная область медицины, которая сопряжена с большим количеством неудач и побочных эффектов, и в этом ее огромный недостаток. Однако есть еще и этический вопрос, ведь многие ученые выступают категорически против вмешательства в генетическое строение человеческого организма. Именно поэтому, сегодня существует международный запрет на использование в генотерапии половых клеток, а также доимплантационных зародышевых клеток. Сделано это для того, чтобы предотвратить нежелательные генные изменения и мутации у наших потомков.

В остальном же, генная терапия не нарушает никаких этических норм, ведь она призвана бороться с тяжелыми и неизлечимыми заболеваниями, в которых официальная медицина попросту бессильна. И в этом самое главное преимущество лечения генами.
Берегите себя!

Генная терапия

Баранов В.С. Генная терапия – медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал. – 1999. – № 3. – С. 63–68. (Санкт-Петербургский государственный университет)

© Баранов В.С., текст

© Соросовский образовательный журнал, 1999

© А. Афонин, обработка и публикация html-версии, 2006

<http :// afonin -59- bio . narod . ru >

<http :// afonin -59- salix . narod . ru >

ВВЕДЕНИЕ

Решающие достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот, их картировании на хромосомах млекопитаю­щих, и прежде всего человека, впечатляющие успехи проекта "Геном человека" в идентификации и клонировании генов, мутации которых приводят к мно­гочисленным наследственным болезням, и, нако­нец, бурный рост в области биотехнологии и генной инженерии явились необходимыми предпосылками для того, чтобы от опытов на животных и теоретиче­ских построений уже в 1989 году предпринять пер­вые попытки лечения моногенных болезней.

Что же такое генная терапия? Подразумевает ли она лечение с помощью гена как лекарственного препарата или только лечение путем коррекции мутантного гена? Эти и многие другие вопросы неми­нуемо возникают при рассмотрении такого много­обещающего, а возможно, и потенциально опасного для человечества направления медицины грядуще­го XXI века, как генная терапия.

КРАТКАЯ ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекцион­ных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения ген­ных дефектов или придания клеткам новых функ­ций. Первые клинические испытания методов ген­ной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирую­щей меланомы. Первым моногенным наследствен­ным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался на­следственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA ). 14 сентя­бря 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1:100000), были пересажены ее собст­венные лимфоциты, предварительно трансформи­рованные вне организма (ex vivo ) геном ADA (ген ADA + ген пео + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3…5 месяцев. За три года терапии в общей слож­ности проведены 23 внутривенные трансфузии ADA - трансформированных Т-лимфоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бо­яться случайных инфекций. Столь же успешным оказалось и лечение второй пациентки с этим забо­леванием. В настоящее время клинические испыта­ния генной терапии этого заболевания проводятся в Италии, Франции, Великобритании и Японии.

В 1997 году число допущенных к клиническим испытаниям протоколов уже составляло 175, более 2000 пациентов приняли участие в их реализации . Большинство таких проектов (около 80%) каса­ются лечения онкологических заболеваний, а также ВИЧ-инфекции (СПИДа). Вместе с тем и в совре­менных исследованиях по генной терапии необхо­димо учитывать, что последствия манипулирования генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недостаточно.

В странах с наиболее продвинутым уровнем ис­следований в этой области, особенно в США, меди­цинские протоколы с использованием смысловых последовательностей ДНК подвергаются обяза­тельной экспертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. В США таковыми являются Консульта­тивный комитет по рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory Committee, RAC) и Управление по лекарствам и пищевым продуктам (Food and DrugAdministration, FDA) с последующим обяза­тельным утверждением проекта директором Наци­ональных институтов здоровья (National Institutes of Health). В Европе такие протоколы составляют и утверждают в соответствии с рекомендациями Ев­ропейской рабочей группы по переносу генов и ген­ной терапии (European Working Group on HumanGene Transfer and Therapy).

МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФЕКЦИИ В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Решающим условием успешной генотерапии яв­ляется обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужерод­ного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель­ного функционирования его в этих клетках и созда­ние условий для полноценной работы гена (его экспрессии). Трансфекция может проводиться с ис­пользованием чистой ("голой" - naked) ДНК, леги­рованной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК (плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками (трансферрин), ор­ганическими полимерами (DEAE-декстран, поли­лизин, липосомами или частицами золота), или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации.

Основные методы доставки чужеродных генов в клетки разделяются на химические, физические и биологические. Эффективность трансфекции и интеграционная способность трансдуцированной чу­жеродной ДНК при различных способах трансфек­ции в ДНК-клетки мишени неодинакова. Только вирусные векторы или генетические конст­рукции, включающие вирусные последовательнос­ти, способны к активной трансдукции, а в некото­рых случаях и к длительной экспрессии чужеродных генов. Из более 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по генотерапии более 120 предполагают использовать вирусную трансдукцию и около 100 из них основаны на применении ретровирусных векторов.

Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro век­торные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro прак­тически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие харак­теристики существующих векторных систем – стабильность интеграции, регулируемая экспрес­сия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных доработках.

Прежде всего это касается стабильности интег­рации. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной ин­теграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных сис­тем, либо путем создания достаточно ста­бильных эписомных векторов (то есть ДНК-струк­тур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

Рецептор-опосредованный перенос генов заключается в следующем. ДНК-последовательность нужного гена соединяют с определенным веществом (например, гликопротеином), который обладает высоким сродством к определенному мембранному рецептору трансформируемой клетки (например, гепатоцита). Полученный комплекс соединяют с аденовирусом, обеспечивающим проникновение генной конструкции в ядро клетки. Такой комбинированный вектор обеспечивает эффективную адресную доставку гена в определенные клетки.

В последнее время особое внимание уделяет­ся созданию векторов на базе искусственных хромо­сом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосо­мы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходи­мы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может прово­диться либо в культуре клеток (ех vivo), либо непосредственно в организме (in vivo ). Клеточная генная терапия или терапия ех vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента in vitro , введение в них чужеродных генов (например, усиливающих иммунный ответ организма), отбор трансфецированных клонов клеток и реинфузию (введение) их тому же пациенту. В настоящее время в большин­стве допущенных к клиническим испытаниям про­грамм генной терапии используется именно этот подход.

Генная терапия in vivo основана на прямом вве­дении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Особенно перспектив­ным для лечения генных болезней invivo представ­ляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний (муковисцидоз, рак легких).

Разработке программы генной терапии предше­ствуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распреде­ления его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответству­ющего медицинского протокола. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболева­ния проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально активен данный ген. На этих клеточных моделях оцени­вают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы коррекции на биохимическом уровне.

Используя культуры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных мо­делях соответствующих наследственных болезней у животных. Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежела­тельных побочных эффектов генной терапии явля­ются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний.

Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию по­следовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) ге­нетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обес­печивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эф­фективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro ) и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Толь­ко после этого можно приступать к программе кли­нических испытаний.

ГЕНОТЕРАПИЯ МОНОГЕННЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Успех первых клинических испытаний явился мощным стимулом для ускорения развития новых генотерапевтических методов применительно к другим наследственным болезням. Ниже приве­ден список болезней, для которых принципиаль­но возможен генотерапевтический подход, генокоррекция которых с большой вероятностью будет осуществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания, для которых уже имеются официально утвержденные протоколы и которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.

Таблица 1 – Наследственные заболевания, генокоррекция которых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспериментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ)

ГЕНОТЕРАПИЯ НЕНАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Одновременно с развитием исследований в об­ласти генокоррекции наследственных дефектов успешными также оказались поиски методов терапевтического использования смысловых последо­вательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний, и главным образом злокачественных опухолей и вирусных инфекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии поиски путей ге­нокоррекции проводятся особенно интенсивно, а число уже одобренных протоколов клинических ис­пытаний во много раз превышает число таковых для лечения моногенных болезней.

Ниже перечислены основные методологичес­кие подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и уже широко используемые. Мно­гие из этих подходов вполне приложимы и для борь­бы с наиболее серьезными инфекционными заболе­ваниями, например с ВИЧ-инфекцией (СПИДом).

Результаты первых клинических испытаний этих подходов оказались в высшей степени обнаде­живающими, в особенности при лечении нейродегенеративных и онкологических заболеваний нерв­ной системы.

Таблица 2 – Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний

НЕКОТОРЫЕ ЭТИЧЕСКИЕ И СОЦИАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Появление принципиально новых технологий, позволяющих активно манипулировать с генами и их фрагментами и обеспечивающих адресную доставку новых блоков генетической информации в заданные участки генома, стало важным событием в биологии и медицине.

Уже сейчас на современном уровне знаний о геноме человека теоретически вполне возможны та­кие его модификации с целью улучшения некото­рых физических (например, рост), психических и интеллектуальных параметров. Таким образом, со­временная наука о человеке на своем новом витке развития вернулась к идее улучшения человеческой породы, когда-то постулированной выдающимся английским генетиком Ф. Гальтоном и развитой его учениками и последователями в Великобритании (К. Пирсон, Л. Пенроуз, Дж. Холдейн), в России (Н.К. Кольцов, Ф.П. Филипченко), в США (Г. Мёллер). Дальнейший ход истории, как известно, пол­ностью дискредитировал саму идею улучшения че­ловеческой породы. Однако грядущее всевластие человека над собственным геномом заставляет вновь и вновь возвращаться к этой теме, делает ее предметом постоянных оживленных дискуссий в широкой и научной печати. Не вызывает сомне­ния, что первоначальные опасения, связанные с генной инженерией человека, были неоправданны. Уже признано целесообразным применение генной терапии для лечения многих заболеваний. Единст­венным и непременным ограничением, сохраняю­щим свою силу и в современных условиях, является то, что все генотерапевтические мероприятия долж­ны быть направлены только на конкретного боль­ного и касаться исключительно его соматических клеток.

Современный уровень знаний не позволяет про­водить коррекцию генных дефектов на уровне по­ловых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусст­венными генными конструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества. Вместе с тем в научной ли­тературе все чаще и настойчивее раздаются призы­вы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррекции зародышевых и половых клеток че­ловека.

Вот некоторые вопросы, которые должны быть решены в рамках предлагаемой генетиками широ­кой дискуссии по генной терапии.

1. Сможет ли в будущем генная терапия обеспе­чить столь полноценную генокоррекцию, которая не представит угрозы для потомства?

2. В какой мере полезность и необходимость генотерапевтической процедуры для одной супружес­кой четы перевесят риск такого вмешательства для всего человечества?

3. Сколь оправданны будут эти процедуры на фоне грядущего перенаселения планеты?

4. Как будут соотноситься генноинженерные мероприятия на человеке с проблемами гомеостаза общества и биосферы?

Таким образом, генетическая революция, апо­феозом которой явилась генотерапия, не только предлагает реальные пути лечения тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем.

14943 0

Установление локализации и последовательности гена, мутации которого вызывают конкретные заболевания, а также самой мутации и современные способы ее тестирования позволяют диагностировать заболевание в нео- и даже пренатальный период развития организма. Это дает возможность смягчить проявление генетического дефекта с помощью медикаментозного лечения, диеты, переливания крови и т.д.

Однако такой подход не приводит к исправлению самого дефекта и, как правило, наследственные заболевания не излечиваются. Ситуация осложняется еще и тем, что мутация одного гена может давать самые разные последствия на организм. Если мутация гена вызывает изменения активности фермента, который он кодирует, то это может привести к накоплению токсичного субстрата или, наоборот, к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки.

Хорошо известным примером такого заболевания является фенилкетонурия. Его вызывает мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, катализирующего превращение фенилаланина в тирозин. В результате повышается уровень эндогенного фенилаланина в крови, что вызывает неправильное формирование миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток центральной нервной системы и, как следствие, тяжелую умственную отсталость.

Если мутация затрагивает ген структурного белка, то это может приводить к серьезным нарушениям на уровне клеток, тканей или органов. Примером такого заболевания является кистозный фиброз.

Делеция в гене, кодирующем белок, который называется транспортер кистозного фиброза, приводит к синтезу дефектного белка (отсутствие фенилаланина 508) и нарушениям транспорта ионов хлора сквозь клеточные мембраны. Одним из наиболее вредных последствий этого является то, что слизь, которая выстилает и защищает легкие, становится ненормально густой. Это затрудняет доступ к клеткам легких и способствует накоплению вредных микроорганизмов. Клетки, выстилающие воздухоносные пути легких, погибают и заменяются фиброзной рубцовой тканью (отсюда название болезни). В результате пациент погибает от нарушения дыхания.

Наследственные заболевания отличаются сложными клиническими проявлениями, и их традицинное лечение имеет в основном симптоматический характер: для лечения фенилкетонурии назначают безаланиновую диету, дефектные белки заменяют функциональным внутривенным введением, для компенсации утраченных функций проводят трансплантацию костного мозга или других органов. Все эти меры, как правило, малоэффективны, дороги, длительны, и лишь немногие пациенты доживают до старости. Поэтому разработка принципиально новых видов терапии очень актуальна.

Генная терапия

В 1990 г. в США доктором У. Френч Андерсоном (W. French Andrson) были предпринята первая попытка генотерапии для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) у трехлетней девочки Ашанти де Силва (Ashanthi da Silva). Это заболевание вызывается мутацией в гене, кодирующем аденозанаденилазу (АДА). Дефицит этого фермента способствует накоплению в крови аденозина и дезоксиаденозина, токсическое действие которых приводит к гибели В- и Т-лимфоцитов периферической крови и, как следствие, иммунодефициту.

Дети с таким заболеванием должны быть защищены от любых инфекций (содержаться в специальных стерильных камерах), поскольку любая болезнь может оказаться смертельной. Через 4 года после начала лечения у ребенка наблюдалась экспрессия нормально функционирующей АДА и облегчение симптомов ТКИД, что позволило ей покинуть стерильную камеру и жить нормальной жизнью.

Таким образом, была продемонстрирована принципиальная возможность успешной генетической терапии соматических клеток. Начиная с 90-х гг. проходят испытания генной терапии целого ряда генетических заболеваний, среди которых такие тяжелейшие, как гемофилия, СПИД, разные виды злокачественных новообразований, муковисцидоз и др. На данный момент поддаются излечению с помощью трансгенеза уже около 10 болезней человека.

Разнообразие генетических заболеваний предопределило развитие множества подходов генной терапии. При этом решаются 2 главные проблемы: средство доставки терапевтического гена; способ обеспечения адресной доставки к клеткам, предназначенным для коррекции. К настоящему времени все подходы к генной терапии соматических клеток можно разделить на две категории: терапия ex vivo и in vivo (рис. 3.15).

Рис. 3.15. Схема проведения генной терапии ex vivo (а) и in vivo (а)

Генная терапия in vivo предусматривает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Рассмотрим эти подходы подробнее.

Генная терапия ex vivo включает следующие этапы:
1) получение дефектных клеток больного и их культивирование;
2) перенос нужного гена в изолированные клетки с помощью трансфекции терапевтической генной конструкции;
3) отбор и наращивание генетически исправленных клеток;
4) трансплантация или трансфузия этих клеток пациенту.

Использование собственных клеток пациента гарантирует, что после их возвращения у него не разовьется иммунный ответ. Процедура переноса генной конструкции должна быть эффективной, а нормальный ген должен стабильно поддерживаться и непрерывно экспрессироваться.

Средством переноса генов, созданного самой природой, являются вирусы. С целью получения эффективных векторов для доставки генов в основном используют две группы вирусов - аденовирусы и ретровирусы (рис. 3.16). В генной терапии применяют варианты генетически обезвреженных вирусов.

Рис. 3.16. Вирусы, применяемые для создания терапевтических векторов

Рис. 3.17. Генетическая карта типичного ретровируса (а) и карта ретровирусного вектора (а)

При получении ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретро-вируса встраивают в плазмиду, удаляют большую часть гена gag и полностью гены pol и env, а вместо них встраивают «терапевтический» ген Т и при необходимости маркерный селективный ген Rg с собственным промотором (рис. 3.17, б). Транскрипция гена Т будет контролироваться все тем же сильным промотором, локализованным на 5"-LTR участке. На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы и максимальный размер ДНК-вставки примерно 8 тыс. п.о.

Полученную таким образом конструкцию можно саму по себе использовать для трансформации, но ее эффективность и последующая интеграция в геном клетки-хозяина крайне низки. Поэтому была разработана методика упаковки полноразмерной РНК ретровирусного вектора в интактные вирусные частицы, которые с высокой частотой проникают в клетку и гарантированно встраиваются в геном хозяина. Для этого была создана так называемая «пакующая» клеточная линия. В двух разных участках хромосом этих клеток вшиты ретровирусные гены gag и pol-env, лишенные способности паковаться из-за отсутствия последовательности + (84*+) (рис. 3.18).

Рис. 3.18. Схема получения упакованного вирусного вектора

Ретровирусы активно инфицируют только интенсивно делящиеся клетки. Для переноса генов их обрабатывают очищенными частицами упакованного ретровирусного вектора или совместно культивируют с производящей их клеточной линией, а затем осуществляют селекцию для разделения клеток-мишеней и пакующих клеток.

Трансдуцированные клетки тщательно проверяют на уровень синтеза продукта терапевтического гена, отсутствие компетентных по репликации ретровирусов, отсутствие изменений способности клеток к росту или функционированию.

Наиболее пригодными для проведения генной терапии являются клетки костного мозга. Это связано с наличием в нем тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые могут пролиферировать и дифференцироваться в различные типы клеток -В- и Т-лимфоциты, макрофаги, эритроциты, тромбоциты и остеокласты. Именно эти клетки применяют для лечения целого ряда наследственных заболеваний, среди них уже упомянутый нами тяжелый комбинированный иммунодефицит, болезнь Гоше, серповидноклеточная анемия, талассемия, остеопороз и др.

Помимо тотипотентных стволовых клеток костного мозга, которые трудно выделять и культивировать, используют стволовые клетки из пупoвинной крови (предпочтительное использование для генотерапии новорожденных), а также клетки печени - гепатоциты - для лечения гиперхолестеролемии.

При генной терапии in vivo особенно важно обеспечить доставку терапевтического гена к дефектным клеткам. Такую адресную доставку могут обеспечить модифицированные векторы, созданные на основе вирусов, способных инфицировать специфические виды клеток. Рассмотрим подход, разработанный для лечения уже упомянутого выше кистозного фиброза. Поскольку легкие являются открытой полостью, терапевтические гены к ним доставить относительно легко. Клонированный вариант здорового гена был введен в инактивированный аденовирус (рис. 3.19). Специфика этого типа вируса заключается в том, что он инфицирует выстилку легких, вызывая простуду.

Рис. 3.19. Схема получения вектора на основе аденовируса

Кроме ретро- и аденовирусов в экспериментах по генной терапии используют и другие типы вирусов, например вирус Herpes simplex. Особенностью этого двунитевого (152 тыс. п.о.) ДНК-вируса является его способность специфически поражать нейроны. Известно множество генетических заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему - опухоли, метаболические нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона).

Вирус простого герпеса I типа (HSV) является весьма подходящим вектором для терапии таких заболеваний. Капсид этого вируса сливается с мембраной нейрона, и его ДНК транспортируется в ядро. Предложено несколько способов переноса терапевтического гена с помощью HSV-векторов и проведены успешные испытания на экспериментальных животных.

Вирусные векторы имеют несколько недостатков: высокая стоимость, ограниченная клонирующая емкость и возможная воспалительная реакция. Так, в 1999 г. в результате развившегося необычайно сильного иммунного ответа на введение аденовирусного вектора погиб 18-летний доброволец, принимавший участие в испытаниях препарата. В 2002 г. у двух детей во Франции во время лечения от иммунодефицита (введением терапевтических генов в стволовые клетки с помощью ретровирусов) развилось состояние, похожее на лейкемию.

Поэтому разрабатываются невирусные системы доставки генов. Самый простой и неэффективный способ - это инъекция плазмидной ДНК в ткани. Второй подход - это бомбардировка тканей микрочастицами золота (1-3 мкм), конъюгированными с ДНК. При этом терапевтические гены экспрессируются в тканях-мишенях и их продукты - терапевтические белки - поступают в кровь. Основным недостатком этого подхода является преждевременная инактивация или разрушение этих белков компонентами крови.

Доставку ДНК можно осуществить, упаковав ее в искусственную липидную оболочку. Полученные таким образом сферические частицы-липосомы легко проникают через клеточную мембрану. Созданы липосомы с самыми разными свойствами, однако пока эффективность такой доставки невысока, поскольку большая часть ДНК подвергается лизосомному разрушению. Также для доставки генетической конструкции синтезируют конъюгаты ДНК с различными молекулами, способными обеспечить ее сохранность, адресную доставку и проникновение в клетку.

В последние годы проводятся интенсивные эксперименты по созданию искусственной 47-й хромосомы, которая позволила бы включить большое количество генетического материала с полным набором регуляторных элементов для одного или нескольких терапевтических генов. Это дало бы возможность использовать геномный вариант терапевтического гена и тем самым обеспечить его стабильность и эффективную длительную экспрессию. Проведенные эксперименты показали, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей терапевтические гены, вполне реально, однако пока непонятно, каким образом вводить такую огромную молекулу в ядро клетки-мишени.

Основными проблемами, которые стоят перед генной терапией, помимо риска тяжелой иммунной реакции, являются трудности длительного хранения и функционирования терапевтической ДНК в организме пациента, мультигенность многих болезней, делающая их трудной мишенью для генной терапии, а также риск использования вирусов в качестве векторов.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

Первая часть (до синей линии) это введение в генотерапию, в принципе, чтобы лучше понять сами методы, и, чуть что, не быть словленным преподавателем. Если нету времени и нужен КОНКРЕТНО материал по вопросу, пролистывайте сразу за синюю линию.

Генная терапия первоначально нацеливалась на лечение моногенных наследственных заболеваний, но затем область её применения расширилась, и она стала рассматриваться как потенциально универсальный подход к лечению всего спектра болезней, включая также инфекционные заболевания, рак, атеросклероз, диабет и ряд других.

«Лечение генов» - исправление дефекта в гене (моногенные болезни) – на уровне соматических и половых клеток – замена мутантного гена на нормальный.

«Лечение генами» - коррекция дефекта путем введения полноценного работающего гена (кДНК).

Сначала немного общей теории:

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).

Стратегии коррекции генетических дефектов:

По типу векторной системы:

Вирусная

Преимущества вирусных векторов : трансдукция большого числа клеток; тропизм; устойчивость к лизосомной деградации.

Недостатки вирусных векторов : иммуногенность (со смертельными исходами – адено- и герпесвирусы); потенциальная канцерогенность (ретровирусы).

Невирусная

· Прямая инъекция в клетку, ткань, орган (она же микроинъекция);

· Липофекция (с помощью различных модифицированных липосом (липидных пузырьков с ДНК внутри);

· Электропорация;

· В составе плазмиды;

· Комплексиррованная ДНК(плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками и тд.);

· Генное ружье (ДНК присоединено к золотым частицам, выстреливаемых в ткани пациента);

· Рецептор-опосредованный эндоцитоз.

Преимущества невирусной доставки : относительная безопасность; отсутствие иммунного ответа; простота применения.

Недостатки невирусной доставки : низкая эффективность трансфекции; низкий уровень экспрессии.

Теоритически наиболее радикальным и эффективным способом является замена дефектного гена в половых клетках (фетальная генотерапия), однако есть этические проблемы. На данный момент все геннотерапевтические подходы базируются на генотерапии на уровне соматических клеток.

По механизму действия встраиваемого гена или переносимой молекулы ДНК, генотерапия делится на положительную (восстановление функции гена(через восстановление его работы или вставки новой рабочей копии) или отрицательную – подавления функции гена). Плюс существует подход направленный на усиление иммунного ответа, который используется в основном в генотерапии рака (об этом ниже).

Так же новую ген информацию можно вносить в организм человека, в составе его же предварительно трансформированных in vitro клеток г.з. ex vivo подход. Подход, при котором, ген информация вводится непосредственно в клетки живого человека, называется (внезапно) in vivo, локальное введение в какие-то определенные участки называется in situ. На данный момент существуют успешные прецеденты введения ген информации in utero (в эмбрион), в Великобритании, совсем недавно спасли ребенка от митохондриальной болезни.

Дополнительные генотерапевтические подходы:

· Антисенс ДНК, РНК (+): специфичность, можно исп в любом векторе, неиммунногенные; (-): быстрая деградация в клетке);

· Рибозимы (+): обладают свойствами ферментов – не расходуются, способны к катализу расщепления мишени, в отличие от белков неиммунногенны, индуцируют синтез интерферона; (-): быстрая деградация;

· Трансдоминантные негативные белки;

· Одноцепочечные антитела;

· Суицидные гены (вместо «лечения» клетки, ее можно просто убить, используется в антираковых системах, (подробнее будет ниже);

· Введение антиген-специфичных лимфоцитов;

· Химеропластика (гибриды ДНК/РНК шпилечной структуры, производят гомологичную рекомбинацию в ядре);

Тут идут исключительно примеры генотерапевтических методов, описания заболеваний смотрите в предыдущих по нумеровке билетах.

Моногенные заболевания:

Недостаточность аденозиндезаминазы (АДА синдром) – первый относительно удачный пример использования генотерапии. Она была осуществлена 14 сентября 1990 года. Эта дата считается днем рождения реальной генной терапии.

С помощью лейкофореза из периферической крови выделяли мононуклеарные клетки, затем их растили в культуре в условиях пролиферации Т-клеток. Затем в пролиферирующие в условиях in vitro клетки вводили ретровирусный вектор, который содержал нормальный ген ADA. Через несколько дней трансдуцированные клетки крови вводили обратно пациентке. Процесс повторяли 7 раз на протяжении 10 месяцев. Эффект был положительным, ¼ лифоцитов в организме получили рабочий ген. Раз в 3-5 месяцев введение модифицированных клеток повторяли. В настоящее время генная терапия данного заболевания развивается в направлении использования стволовых клеток пациента. Это позволит значительно сократить количество введений модифицированных клеток за счет их многократных делений уже в самом организме и при достижении селективного и количественного преимущества модифицированных стволовых клеток над нативными сформирует достаточный уровень фермента в организме.

Наследственная гиперхолестеролемия - Известно, что неделящиеся гепатоциты не могут быть инфицированы ретровирусами. После гепатоэктомии гепатоциты начинают пролиферировать и приобретают способность инфицироваться ретровирусами. В гепатоциты, полученные из печени больного, с помощью ретровирусного вектора была введена кДНК гена нормального рецептора LDL-R. После реинфузии рекомбинантных гепатоцитов через воротную вену в печень наблюдалось уменьшение содержания в крови липопротеинов низкой плотности (в частности, холестерина) и соотношения липопротеинов низкой плотности к липопротеинам высокой плотности. Это означает, что введенные клетки функционировали in vivo и осуществляли интернализацию и обмен холестеринов.

Гемофилия В – Были проведены успешные опыты на собаках с использованием стратегии ех vivo с
доставкой в гепатоциты кДНК, кодирующей фактор IX. Удалось добиться синтеза фактора IX в количествах, составляющих 0,1% от нормального количества фактора IX в плазме крови. При попытке повысить концентрацию фактора IX были использованы аденовирусные векторы, однако эффект был недолговременным. Кровь животных свертывалась, однако эффект полностью пропадал после 2х месяцев (типичный недостаток аденовирусных векторов).

Гемофилия A - Появились сообщения об успешном введении мышам укороченного гена фактора VIII в составе ретровирусного вектора. В результате достигается терапевтический уровень фактора в крови.

Муковисцидоз - Показано, что замена 6-10% клеток легочного эпителия трансфецированными клетками позволит восстановить нормальные транспортные функции трансмембранных каналов, обеспечивающих перенос ионов хлора. Ретровирусы не подходят, так как не ифицируют неделящиеся клетки, аденовирусы подходят с оговорками, так как в опытах на мышах вызывали воспалительные реакции. Проблема дополнительно заключается в барьере из гликокаликса на поверхности клеток. Один из подходов для решения данной проблемы заключается в модификации вектора, который включает в себя определенный лиганд к рецептору на поверхности клеток легочного эпителия. Взаимодействие лиганда с рецептором обычно приводит к интернализации вектора вместе с рецептором внутрь клетки. В качестве такого рецептора был выбран трансмембранный рецептор P2Y2-R. Этот рецептор участвует в запуске каскада воспалительных реакций в полости легких. В качестве лиганда использовались либо моноклональные антитела к этому рецептору, либо природный лиганд - биотинУТФ.

Мышечная дистрофия Дюшена - Болезнь начинает проявляться в детстве, и генная терапия должна проводиться в это же время. Наиболее перспективным является использование аденовирусных векторов. Из-за большой длины гена, исследователи используют укороченные, но функциональные копии белка. ксперименты на мышиных моделях, которые имеют дефектный ген дистрофина, показали, что от 5 до 50% мышечных клеток экспрессировали усеченный белок дистрофин. Этого было достаточно для сведения к минимуму мышечной дегенерации. Существуют данные о клинических испытаниях генетической конструкции, несущей ген дистрофина, для терапии больных мышечной дистрофией Дюшена. Больные дети после инъекции в мышцы такой конструкции приобретали способность двигаться. Однако, эффект был кратковременным.

Многофакторные заболевания на примере онкологических заболеваний:

Рак это, как правило, следствие многоступенчатых изменений клетки. Сложность, связанная с участием множества генов и их продуктов в опухолевом процессе, вызывала сомнения в эффективности генной терапии раковых заболеваний. Однако, существуют многочисленные эксперименты, показывающие, что компенсация единственного гена-супрессора может приводить к подавлению опухолевых свойств клеток.

Иммунотерапия рака:

Использование генотерапевтических конструкций, стимулирующих иммунный (в основном клеточный) противоопухолевый ответ. Для создания ген-конструкций используют гены: Антигенов (на который срабатывает иммунная система); Комплекса MHCI(главный комплекс гистосовместимости); фактора B7; Цитокинов; Рецепторов Т-клеток. Подавление развития опухоли может быть достигнуто клонированием генов цитокинов: интерлейкинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, а также фактора некроза опухолей –α (TNF- α), интерферонов (INF- α, INF-ϒ)

Подавление роста раковых клеток введением в них генов, продукты которых подавляют развитие опухоли:

· Гены-супрессоры опухоли (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, Cyclin D)

· Суицидные гены

· Ингибиторы онкогенов

· Факторы антиангиогенеза

· Ингибиторы циклинов

· Гены, повышающие чувствительность клеток опухоли к лекарственным соединениям

· Гены транспортеров лекарственных соединений (введение, например, в клетки костного мозга)

Колоссальное значение имеет в подавлении онкогенов ген p53(отвечает за апоптоз и способен остановить клеточный цикл, предотвращая бесконтрольное деление), поэтому его мутация практически всегда ведет в злокачественному перерождению клетки. Для внесения рабочей копии гена p53 в организм используются аденовирусные вектора. После начала экспрессии гена p53 в ядре раковой клетки, он индуцирует ее апоптоз.

Другим подходом является подавление работы онкогенов . Мутация в гене RAS способна привести к конститутивной работе сигнальной системы запуска деления (MAP киназный каскад, вспоминаем Николайчика J). Чтобы заблокировать этот ген, можно 1)ингибировать экспрессии RAS введением интактного гена; 2)ингибирование RAS рибозимами; 3)ингибирование нижележащих в сигнальном пути генов; 4)препятствие встраивания RAS белка в мембрану.

Использование онколитических вирусов. Вирусный онколизис - это принципиально новый подход к терапии онкологических заболеваний, основанный на естественной способности вирусов убивать (лизировать) клетки, в которых он размножается. Для этого используются реовирусы, полиовоирусы, эховирусы и вирусы Коксаки + некоторые модифицированные аденовирусы, которые преимущественно размножаются в опухолевых клетках и ведут их к апоптозу. В настоящее время проводятся клинические испытания препарата REOLYSIN, выпускаемого компанией Oncolytic Biotech. Очень перспективными считаются аденовирусы, экспрессирующие антиангиогенные белки.

30 августа 2017 года Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (FDA) одобрена первая в мире генная терапия рака крови . Речь идет о Kymriah (tisagenlecleucel) компании Novartis Pharmaceuticals, который создан на основе технологии CAR-T и предназначен для лечения В-клеточного острого лимфобластного лейкоза у детей и молодых взрослых пациентов до 25 лет, рефрактерным к другим методам лечения или имеющим рецидив заболевания.

Использование технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 открывает новые возможности в генной терапии. CRISPR/Cas9 позволяет очень точно и безопасно изменять ДНК клеток. И если совместить технологию CRISPR/Cas9 с доставкой при помощи аденоассоциированных вирусов, то это, по-видимому, позволит системно воздействовать на организм и совершенно безопасно изменять геном очень большого числа клеток.

И вот в 2016 году генетики из университета Дьюка (США) объявили, что им впервые в истории удалось успешно провести генную терапию взрослого млекопитающего (мыши) и вылечить его от генетического заболевания, связанного с дистрофией мышц. Для этого была использована модифицированная версия сравнительно новой технологии редактирования генов CRISPR/Cas9. Технология редактирования генов CRISPR/Cas9 связана с использованием аденоассоциированного вируса, помогающего доставлять генетический материал до места назначения. При помощи этой технологии были проведены успешные опыты по редактированию генов отдельных клеток в пробирках и одноклеточных эмбрионов. К сожалению, пока что возможность генетических манипуляций на эмбрионах человека вызывает ожесточённые споры.

CRISPR/Cas превзошел все ожидания. Он позволила с минимальным числом ошибок как «выключать» нужные гены, так и встраивать новые гены в строго определенные участки генома.

В декабре 2015 года научная группа Фенга Джанга видоизменила данную систему так, что она стала и вовсе безошибочной, что было опубликовано в ведущем научном журнале Science. Ученые заменили 3 аминокислоты «кирпичики», из которых состоит белок) в эндонуклеазе Cas9, после чего число ошибок такой системы свелось практически к нулю.

Использование CRISP/Cas9 особенно актуально для генной терапии старения, где требуется воздействовать на пути долголетия, общие для большинства клеток организма. По генной терапии старения до 2015 года не проведено ни одного клинического испытания на людях, что неудивительно, поскольку старение до сих пор не признано болезнью.

Кроме того, генная терапия старения пока еще очень молодая и развивающаяся область. Сейчас все исследования по генной терапии старения проводятся на модельных мышах, крысах, обезьянах и клеточных культурах человека - клетках в пробирке.

Все подходы к генной терапии старения делятся на те, где в организм доставляется ген долголетия, и на те, где вводятся малые РНК, «выключающие» ген или путь старения. То есть в первом случае вводится нечто полезное для долголетия, а во втором - отключается вредное. В строгом смысле исследований по генной терапии старения на млекопитающих до 2015 года было проведено только два.

Гораздо больше работ моделируют генную терапию на трансгенных мышах. В таких исследованиях терапевтический ген не доставляют в организм взрослой мыши, а при помощи генной инженерии создают мышей, геном которых изменен с рождения. Как и генная терапия, это позволяет исследовать, как увеличение или снижение активности разных генов влияет на продолжительность жизни и старение организма.

Давайте рассмотрим, что можно теоретически сделать с помощью генной терапии и генной инженерии для борьбы со старением.

Преимущество генной терапии перед другими способами продления жизни

Поэтому, если мы говорим о трансляции исследований по продлению жизни на человека, то генная терапия имеет абсолютное преимущество, поскольку не снижает качество жизни из-за необходимости постоянного лечения - соблюдать ежедневно определенную диету или же постоянно употреблять геропротекторы или другие лекарства. Также генная терапия высокотаргетна и поэтому имеет потенциал к меньшему числу побочных эффектов.

Кроме того, лекарственные средства имеют ограничения по биодоступности в различные ткани и органы.

Внедрение гена теломеразы (TERT) у двухлетних мышей дикого типа (40-50 лет по человеческим меркам) с помощью одной инъекции увеличивает длину теломеров и продлевает им жизнь на 20%.

Ученый предположил, что в клетках существует некий счетчик делений, ограничивающий их общее число. Спустя 10 лет российским ученым Алексеем Оловниковых был предложен гипотетический механизм работы этого счетчика.

Оловников предположил, что при делении клеток концы хромосом, называемые теломерами, немного сокращаются. А когда теломеры достигают критической длины, клетка перестает делиться и стареет. В дальнейшем Элизабет Элен Блэкбёрн - американский учёный-цитогенетик, стала лауреатом Нобелевской премии по физиологии или медицине за 2009 год совместно с Кэрол Грейдер и Джеком Шостаком с формулировкой «за открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы» по теории, в 1971 году предложенной Алексеем Оловниковым.

В нестареющих клетках (например, половых и эмбриональных стволовых), напротив, должен существовать фермент, который удлиняет теломеры, позволяя клеткам делиться практически до бесконечности. Кроме того, было показано, что повреждение гена теломеразы сильно сокращает жизнь модельных животных и приводит к возникновению синдрома преждевременного старения - прогерии.

После открытия теломеразы десятки ученых загорелись тем, чтобы сделать на ее основе лекарство от старости. Казалось бы, «включение» теломеразы во всех клетках может сделать организм бессмертным. Однако вскоре возникли опасения в связи с тем, что активный синтез теломеразы наблюдается и в 90% раковых опухолей. Встал вопрос: не приведет ли активация теломеразы к риску злокачественной трансформации?

Кроме того, оказалось, что старение клеток далеко не всегда сопровождается сокращением теломер. Например, в случае эпителиальных клеток слизистой полости рта или роговицы глаза человека. Это говорило о том, что одной активации теломеразы может быть недостаточно для омоложения всего организма. Перед тем как перейти к генной терапии, эффекты теломеразы исследовались на трансгенных мышах. Оказалось, что если «включить» ген TERT во всех клетках мыши, то продолжительность жизни увеличивается на 40%! Однако постоянная активность теломеразы увеличивала и риск рака. Поэтому стал вопрос о том, как активировать работу теломеразы на более короткий срок.

Сегодня простимулировать теломеразу можно и лекарствами. Интересное исследование в этой области провели ученые из Университета Любляны (Словения) в 2016 году после ряда успешных клинических испытаний по омоложению сосудов низкими дозами валсартана и флувастатина. На этот раз они измерили активность теломеразы после омоложения сосудов в образцах крови 130 пациентов пациентов.

Так одномесячный курс существенно повышает активность теломеразы в 3.28 раза , которая достоверно коррелирует с улучшением эндотелиальной функции (омоложением сосудов) и снижением воспаления в кровеносных сосудах. И этот повышенный уровень теломеразы сохраняется, постепенно снижаясь, ещё полгода. Но насколько эффективно такое повышение теломеразы влияет на теломеры ещё предстоит определить.

Важно знать, что теломеры не обязательно могут продлить нам жизнь, если подобную терапию делать не в нужный момент и слишком долго.

К тому же одна лишь стимуляция теломеразы может не удлинить теломеры. Активность теломеразы с возрастом почти не меняется - вот посмотрите график слева. А теломеры всё равно сокращаются.

Также сегодня есть на рынке препарат, который повышает активность теломеразы - ТА-65. Он очень дорогой, а жизнь мышей никак не продлевал в исследованиях. Вот смотрите график слева. В исследовании 2011 года ученые из Испанского Национального Онкологического Центра начали давать долгоживущим двух летним мышам ТА-65 для повышения теломеразы, как и в предыдущем исследовании. Только в предыдущем исследовании мышам делали инъекцию для генной терапии. Но препарат ТА-65 никак не продлил жизнь мышам в отличие от генной терапии (см. график слева) и оказался абсолютно бесполезным для продления жизни и замедления старения.

В 2011 году ученые из Техасского Университета исследовали теломеры и теломеразу в культурах клеток более 60 видов млекопитающих . Роль теломер в долголетии оказалось не так очевидна… Исследования показывают (при сравнении около 60 видов млекопитающих), чем длиннее теломеры у вида, тем быстрее накапливаются у него мутации ДНК, больше раковых опухолей и короче продолжительность жизни. Длина теломер обратно коррелирует с продолжительностью жизни. Это даёт основания предполагать, что результат по продлению жизни теломеразой, который был получен на мышах с помощью одной инъекции, может не продлить жизнь людям. Вопрос по теломерам для людей остаётся открытым.

Вывод: В будущем теоретически мы сможем с помощью внедрения гена теломеразы (TERT) в возрасте 40-50 лет с помощью одной инъекции увеличивать длину теломеров, но одной такой терапии явно недостаточно. Быстрее всего, мы должны найти сочетание генотерапевтических воздействий, чтобы существенно продлить жизнь человека. Сегодня мы можем имитировать эффект с помощью одномесячной терапии 1 раз в полгода комбинацией препаратов валсартана 20 мг + флувастатина 10-20 мг , либо телмисартан + аторвастатин 10 мг. По крайне мере эти препараты в комбинации способны стимулировать саму теломеразу.

Нарушение работы гена Agtr1a, кодирующего рецепторы ангиотензина AT1a продлевает жизнь трансгенным мышам на 26% в сравнении с мышами дикого типа.

Каплан на примере приматов показал, что если собрать группу самцов приматов, то в течение скольких-то дней у обезьян появится социальная иерархия. Самое худшее место в такой иерархии - это внизу. Самцы приматов, находящиеся в подчиненном положении, демонстрируют ряд показателей хронического стресса. Часто у них возникает атеросклероз. Когда учёные давали самцам приматов, находящимся внизу социальной иерархии (группа риска), бета-блокатор пропранолол , подавляющий активность симпатической нервной системы, то атеросклероз сосудов не развивался.

Оказалось, что симпатическая нервная система из-за стресса негативно влияет на развитие атеросклероза и участвует в проблемах с сердцем и сосудами. Эмоциональный стресс реализует себя через симпатическую (адренергическую) автономную нервную систему, которая связывает управляющие центры нашего мозга и внутренние органы. В том числе - с иммунными, костным мозгом и др. Атеросклероз - главный фактор, который приводит к наибольшему число смертей в развитых странах от инфаркта сердца и инсульта мозга.

Рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование 1983 года , организованное Goldstein S и коллегами, показало, что терапия пропранололом у 3837 пациентов с острым инфарктом миокарда снижает смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (причина смертности №1 в мире).

В марте 2017 года, французские ученые сообщили об успешных клинических исследованиях генной терапии для лечения серповидноклеточной анемии.

Комитет Американской Национальной Академии наук и Национальной Академии медицины дал поддержку редактирования генома человеческих эмбрионов уже в 2017 году . Но только для серьезных заболеваний и под строгим контролем.

Выводы

1. Все подходы к генной терапии старения делятся на те, где в организм доставляется ген долголетия, и на те, где «выключается» ген или путь старения.

2. В сравнении с другими подходами к продлению жизни генную терапию достаточно провести только один раз за всю жизнь.

3. Внедрение гена теломеразы (TERT), нарушение работы гена Agtr1a, нокаут GHRKO, нарушение в генах, кодирующих рецепторы к IGF-1, сверх экспрессия FGF21, нокаут AC5, удаление RIP3, редактирование гена PCSK9, сверх экспрессия Klotho, нокаут RAGE, сверх экспрессия BubR1, сверх экспрессия MTH1 - всё это примеры самых эффективных способов генной инженерии или генной терапии, позволяющих продлевать жизнь животным.

4. Чтобы добиться более существенных результатов в генной терапии старения и в генной инженерии против старения, необходимо комбинировать разные подходы. Добавить метки