Реакция связывания комплемента (РСК). Схема проведения основного опыта реакции Вассермана

борде - жангу реакция

РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:

1) серологической диагностики инфекционных заболеваний (р. Вассермана – при сифилисе, р. Борде–Жангу – при хронической гонорее и др.);

2) идентификации бактерии и др. микробов.

РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ и АТ, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.

РСК проводится в два этапа при участии двух систем:

1) первая система – АГ+АТ+комплемент – обуславливает связывание комплемента в том случае если АТ соответствует АГ. В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;

вторая система (индикаторная) – гемолитеческая сыворотка (гемолизины) + эритроциты – показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т. к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент (см. прилож. 3, рис.7 и 8).

Компоненты реакции:

1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 0 С в течение 30 минут);

2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);

3) комплемент;

4) гемолитическая сыворотка;

5) 3% взвесь эритроцитов барана;

6) физиологический раствор;

7) контрольная сыворотка.

Комплемент . В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.

Титр комплемента – наибольшее разведение комплемента которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Рабочая доза комплемента – количество комплемента, которое выше тира на 25%.

Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50% взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 0 С. Определяют титр и рабочую дозу.

Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.

РСК Борде –Жангу

Реакция ставится для диагностики хронической гонореи с целью обнаружения антител к гонококку.

В РСК участвует 2 системы: основная система – испытуемая сыворотка, антиген, комплемент и вспомогательная, индикаторная или гемолитическая система – гемолитическая сыворотка и эритроциты барана.

Если в первой системе образуются специфический комплекс антиген + антитело, то комплемент адсорбируется (соединяется с этим комплексом) и гемолиза во второй системе не происходит.

Для реакции требуется:

1. Испытуемая сыворотка, которая получается из крови, взятой пункцией локтевой вены больного. После свёртывания крови сыворотка отсасывается в отдельную пробирку и инактивируется 30 минут при 56 0 С на водяной бане.

2. Антиген - взвесь убитых гонококков.

3. Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированной крови. Их отмывают, центрифугируя 3 раза с новыми порциями физиологического раствора. В реакции используют 3 % взвесь эритроцитов.

4. Гемолитическая сыворотка готовится заранее путём иммунизации кроликов эритроцитами барана. Перед употреблением производится титрование сыворотки.

5. Комплемент - свежая сыворотка морской свинки. Из сердца морской свинки шприцем насасывается кровь, после свёртывания отделяется сыворотка. Перед опытом вытитровывается рабочая доза комплемента. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 и разливают его по пробиркам, от 0,1 до 0,5, после чего объем в каждой пробирке доводят физиологическим раствором до 1,5 мл.

Одновременно заготавливают гемолитическую систему - разведенная в тройном титре гемолитическая сыворотка + 3 % взвесь эритроцитов барана. Оба ингредиента в разных объемах и выдерживают в термостате 30 минут (сенсибилизация смеси), после чего смесь добавляют по 1 мл в пробирки помещают в термостат на 30 минут. Контролем служат 3 пробирки:

1. 1мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора;

2. 0,5 мл комплемента 1:10 + 0,5 мл взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора.

Титром комплемента называется его минимальное количество, при котором ещё происходит гемолиз. Для постановления реакции берут рабочую дозу комплемента, увеличенную против титра на 20-25 % т. е., обычно то количество комплемента, которое имеется в предпоследней пробирке с гемолизом. Увеличение дозы комплемента необходимо потому, что в реакции активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами реакции (антиген, сыворотка).

Постановка основного опыта РСК Борде - Жангу.

В начале в 2 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 1-ю пробирку приливается антиген, во вторую физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляются рабочая доза комплемента.

После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 0 С на 30 минут (горячее связывание). При холодном связывании штатив с пробирками помещается в ледник при температуре -4 0 С на 18 часов. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система. Реакция ставится в объёме 0,5 мл. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, после чего производится предварительная регистрация результатов. Пробирки остаются при комнатной температуре, а на следующий день отмечается окончательный результат.

Степень интенсивности реакции оценивается в плюсах. Полная задержка гемолиза - четыре плюса (++++), неполная - три, и один плюс. Полный гемолиз обозначается минусами (-).

РСК Вассермана

Ставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения антител, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является неспецифичность антигена: в качестве антигена употребляют липоидные экстраты из нормальных органов животных.

Для постановки реакции Вассермана необходимо иметь сыворотку больного, диагностикумы перекрестнореагирующие антигены № 1 и № 2, комплемент, гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, физиологический раствор.

Диагностикум № 1 - специфический, трепонемный.

Диагностикум №2 - неспецифический, кардиолипиновый антиген, который представляют собой высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липоидов. Липоиды, экстрагированные из сердца, по химическому составу близки к липоидам бледной трепонемы, поэтому хотя и не являются специфическими, но фиксируют антитела против спирохеты. Указанные антигены выпускаются централизованно и в реакцию употребляются, разведёнными согласно к титру, указанному на этикетке.

Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и заведено положительной сыворотками.

Состав**:

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 40,0 г порошка М175 или 36,0 г порошка М175А или 30,0 г порошка М214 в 1000 мл дистиллированной воды, содержащей 10 мл глицерина. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 45-50°С и асептично внести до 15-20% стерильную дефибринированную кровь (баранью, кроличью, человеческую или лошадиную). Тщательно перемешать, не допуская образования пузырьков воздуха в среде, и разлить среду в чашки Петри.

Принцип и оценка результата:

Этот агар впервые был предложен Борде и Жангу (1). Указанная пропись является модификацией Kendrick (2), которая рекомендована специалистами АРНА. Данные среды применяют для диагностики коклюша. На них при посеве отделяемого глотки, мазков из носоглотки или методом «кашлевых пластинок» можно выделить возбудитель коклюша - Bordetella pertussis .

Картофельный настой и пептический перевар животной ткани являются источником углерода и азота, глицерин и кровь - дополнительными источниками питательных веществ. Ввиду богатого состава эти среды позволяют получать обильный рост бордетелл, их можно использовать для приготовления биомассы бактерий в ходе приготовления коклюшной вакцины (3) или для сохранения лабораторных штаммов бордетелл (1). Обогащение среды 15% бараньей крови преследует цель обнаружения Bordetella pertussis по способности к гемолизу. Добавление 25% человеческой крови позволяет определить присутствие микобактерий в небольшом количестве мокроты, а также определить их чувствительность к стрептомицину (4).

Инкубирование засеянных сред рекомендуют проводить во влажной атмосфере (60%, в камере) при 37°С до 7 суток. Перед посевом среда не должна быть слишком сухой. Через 40 ч колонии Bordetella pertussis выглядят гладкими, выпуклыми, блестящими, с зоной гемолиза. Эти среды можно сделать селективными для бордетелл, если в их состав ввести антибиотик, например, пенициллин (5), метициллин (6) или, что особенно рекомендуется, цефалексин (7). Последний используют в концентрации 40 мкг/мл. В качестве противогрибкового средства в среду можно добавить амфотерицин В (10 мкг/мл).

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий светло-желтый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 2,0%-ному (М175, М214) или 1,6%-ному (М175А) агаровому гелю.

Цвет и прозрачность готовой среды:

Основа среды имеет светло-желтую окраску, прозрачна или слегка опалесцирует при затвердевании. После добавления крови (15% об/об) среда должна иметь вишнево-красный цвет и опалесцирует, если в чашках Петри формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водные растворы М175 (4,0% вес/об), М175А (3,6% вес/об) или М214 (3,0% вес/об) имеет рН 6,7 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 3-4 дня при 35°С.

Цито-бактериоскопический метод . Гонорейное поражение мужских и женских половых органов распознается главным образом путем микроскопического исследования выделений из желез преддверия, уретры, цервикального канала. Нахождение в этих секретах гонококков подтверждает гонорейный характер данного заболевания. Несмотря на многие недостатки, бактериоскопический метод остается до настоящего времени основным методом диагностики гонореи . Остальные методы следует считать дополнительными.

К важнейшим недостаткам бактериоскопического метода следует отнести то, что не всегда удается обнаружить гонококки даже при повторном исследовании и в особенности в хронических случаях, а также трудность дифференцирования гонококков от другой бактериальной флоры. В. И. Константинов и А. С. Жарковская обнаружили гонококки при хронической гонорее у 20-30% женщин, Е. П. Майзель - у 40%, А. И. Петченко - у 31%. Бактериоскопический метод требует повторных исследований; однократное бактериоскопическое исследование при хронической гонорее обнаруживает гонококки лишь в незначительном проценте случаев. Чем длительнее заболевание, тем меньше шансов найти гонококки без применения провокации не только в первичном мазке, но и в последующих.

Если бактериоскопически гонококки обнаружены, то диагноз ясен. Если же они не найдены, то возможность гонореи все же не исключена; в этих случаях необходимо обратить внимание на атипичные формы гонококков. Крайне важно также обратить внимание на характер отделяемого (гной, слизь, серозная жидкость) и особенно на количество в нем форменных элементов (лейкоциты, плоские клетки) и отношение микрофлоры к лейкоцитам.

По Г. А. Бакшту и А. И. Петченко, различают три основных цито-бактериоскопических картины гонореи.

Картина первая. Большое количество сегментированных лейкоцитов (экссудат) при отсутствии посторонней флоры, гонококки расположены внутри или внеклеточно.

Картина вторая. Та же цитологическая картина, но без гонококков. Посторонняя флора отсутствует. Эта картина обнаруживается весьма часто при хронической гонорее и может перейти в первую после провокации. Таким образом, лейкоцитоз без посторонней флоры может считаться картиной, подозрительной на гонорею.

Картина третья. Небольшое количество бесструктурных лейкоцитов в состоянии некробиоза. Обилие посторонней флоры. Появление посторонней флоры следует считать переломом в сторону улучшения при лечении; первыми после гонококка появляются кокковые формы, за ними - грамдиплококки, коккобациллы, палочковидные формы; появление палочковидных форм свидетельствует о начале выздоровления и в большинстве случаев исключает наличие гонококков.

Существует непрерывная динамика изменений картин мазков под влиянием лечения и даже времени.

Бактериологическое исследование . Бактериологический метод диагностики, наиболее доказательный и точный, на практике не получил большого распространения из-за своей сложности и длительности. Большинство авторов считает, что для распознавания гонореи достаточно бактериоскопического исследования.

В связи с развитием учения о сульфаниламидорезистентных формах гонореи методу бактериологических посевов вновь стали придавать большое значение. По Хагерману (Hagermann), гонорея, перешедшая в латентную фазу в результате неполноценной сульфаниламидотерапии, может долго не обнаруживаться бактериоскопически, и только методом посева можно выявить гонококки.

Реакция связывания комплемента по Борде-Жангу . Борде вместе с Жангу разработали технику реакции фиксации комплемента при гонорее.

По концепции В. Е. Дембской, реакция Борде-Жангу не является показателем инфекции, а указывает на сенсибилизацию организма данным инфекционным агентом.

Для постановки реакции Борде-Жангу берут из кубитальной вены в пробирку 5-6 мл крови. В последние годы предлагают пользоваться небольшим количеством крови, полученной из укола шейки матки. Если необходимо переслать кровь на далекое расстояние (в участковой практике), можно пользоваться высушенной сывороткой. Для этого кровь оставляют при комнатной температуре на три часа. После образования свертка его отделяют от стенок пробирки стеклянной палочкой, пробирку же переносят в прохладное место. На следующий день на листок вощаной бумаги размером 6-8 см наливают 0,5 мл сыворотки и дают ей просохнуть в течение суток, предохраняя от солнечного света и пыли. Бумажку с высохшей (в виде стекловидной пленки) сывороткой свертывают подобно аптекарскому порошку и пересылают в лабораторию. Срок годности высушенной сыворотки 10-15 дней.

Большинство авторов признает, что при гонорее нижнего отдела гениталий у женщин реакция Борде-Жангу дает положительный результат лишь в 5-20%. При гонорее верхних отделов эта реакция в большинстве случаев (от 40 до 100%) выпадает положительно. При пиосальпинксах и аднекситах реакция более выражена; при периметритах, периаднекситах и эндометритах - меньше. Лишь в тех случаях гонореи, когда имеются осумкованные очаги в бартолиниевой железе, уретре, цервикальном канале, реакция Борде-Жангу выпадает положительно. Отсюда можно сделать вывод, что результаты реакции зависят не от наличия гонококков в выделениях, а от клинического проявления заболевания, причем глубоко гнездящиеся очаги поражения, обильно омываемые кровью и лимфой, обычно вызывают положительную реакцию.

Реакция Борде-Жангу очень ценна для установления этиологии аднекситов и артритов неясного происхождения. Но она теряет свое значение, если проводилось длительное лечение гоновакциной. Введение гоновакцины здоровым людям вызывает положительную реакцию Борде-Жангу, длящуюся от 1 до 3 месяцев. О сроке наступления положительной реакции после заражения авторы дают различные данные, колеблющиеся между четырьмя днями и шестью неделями; средним сроком следует считать две недели. Относительно времени исчезновения положительной реакции Борде-Жангу после выздоровления нет единого мнения.

В. Е. Дембская, считая эту реакцию показателем аллергических сдвигов в организме, допускает, что она может иметь прогностическое значение (больные, у которых отмечается отрицательная реакция, резистентны к стрептоциду), но отрицает пригодность этой реакции в качестве критерия излеченности.

Реакция Лисовской . Основываясь на работах Дебре и Параф, предложивших определение туберкулезного антигена в моче для диагностики туберкулеза мочевых путей, С. Н. Лисовская предложила применять этот метод для определения гонококкового антигена в моче больных, подозрительных на гонорею. Методика реакции Лисовской заключается в следующем: к испытуемой моче прибавляют противогонококковую сыворотку и комплемент; если в моче содержится гонококковый антиген, то получается отклонение комплемента, при добавлении гемолитической системы гемолиз не наступает. Другие авторы, а также и мы, считают этот метод малоудовлетворительным, так как в 30% случаев наблюдалось несовпадение реакции с результатами клинического исследования.

Реакция Фейгеля . И. И. Фейгель для диагностики женской гонореи, в особенности хронических или латентных форм, предложил реакцию на антиген с выделениями из цервикального канала.

Сущность реакции состоит в том, что с выделениями из цервикального канала ставится реакция отклонения комплемента; это - реакция Борде-Жангу только в обратном порядке: цервикальные выделения служат антигеном, а в качестве антитела берут сыворотку животного, иммунизированного культурой гонококков.

Техника получения материала: на шейку матки на 12-24 часа одевают колпачок Кафки, после чего колпачок с выделениями помещают в стерильную посуду и отправляют в лабораторию для приготовления из выделений антигена. Результаты реакции, по данным Фейгеля, положительные в 80-91,2%. По этому же автору, реакция становится отрицательной после излечения (через 2-4 месяца); таким образом, она имеет значение для критерия излеченности. Ценность реакции для диагностики латентной гонореи подтверждена рядом авторов.

Вакцинодиагностика . Введение гоновакцины - один из старых методов диагностики гонореи. И. Г. Бурлаков, А. Э. Мандельштам, А. И. Петченко, С. М. Беккер считают кожную реакцию весьма ценной для диагностики; по Бурлакову, кожная реакция дает правильный ответ в 70%, по Беккеру - в 75%, по Мандельштаму - в 70-90% и по Петченко - в 97% случаев гонореи.

Кожная реакция подтверждает наличие гонорейного процесса, не показывая активности его; она читается через 48 часов, в первые же сутки считается неспецифической. Реакция остается на некоторое время и по прекращении заболевания.

Выгодно пользоваться высокими титрами (2 млрд. микробных тел в 1 мл); впрыскивают 0,1 мл гоновакцины в верхне-наружную часть бедра. Реакция читается так: 1) краснота около 1 см в диаметре с заметной инфильтрацией - слабоположительная (+); 2) резкая краснота более 1 см в диаметре с ясно ограниченной инфильтрацией - положительная (+ +); 3) те же явления, но при наблюдении через 72 часа - резкоположительная реакция (+ + +). Реакция исчезает через три-четыре дня.

Регионарное (местное) введение гонококкоковой вакцины для диагностики гонореи было предложено Пуанклю и разработано у нас И. Г. Бурлаковым.

Регионарная реакция доказывает, по Бурлакову, наличие живых возбудителей в области локализации процесса, так как в основе этой реакции лежит резкое усиление окислительных процессов, местный ацидоз, а окислительные процессы возможны только при условии, если деструкции подвергаются живые возбудители. В этом основное отличие регионарной реакции от кожной. Техника регионарной реакции заключается в том, что вводят 0,2 мл гонококковой вакцины (400 млн. микробных тел) в слизистую цервикального канала или в слизистую влагалища. Положительной реакцией считают повышение температуры до 38° (+), повышение температуры до 39° - ясно положительной (+ +) и повышение до 40°-резкоположительной реакцией (+ + +).

Кроме повышения температуры, реакция сопровождается ознобом, головной болью, иногда рвотой и местными болями (в области пораженных придатков). Реакция наступает через 15-45 минут и продолжается в течение 2-16 часов. Наивысший подъем температуры наблюдается через три-четыре часа после введения вакцины. Положительные результаты регионарной реакции при явной гонорее наблюдаются в 94,6%, при подозреваемой - в 67,7%. Регионарная реакция сочетает в себе элементы провокации, поэтому на следующий день после введения вакцины следует брать повторно мазки для бактериоскопии. Отрицательной стороной регионарного метода являются бурные реакции, поэтому применение этого метода противопоказано в амбулаторной практике и ослабленным больным.

Определение морфологии крови . Влияние токсина гонококков на морфологию крови больных своеобразно; оно касается, главным образом, состава белой крови. Изменения клеток гноя и крови при лечении гонореи были подробно изучены Е. А. Сельковым. Лейкоцитоз при гонорее, по данным ряда авторов, не повышается, оставаясь большей частью в пределах 4000-10 000 лейкоцитов в 1 мм3 крови. Иногда обнаруживается повышенный лейкоцитоз при острой гонореей при асцендировании процесса. В 89% случаев гонореи верхних отделов женской половой системы лейкоцитоз остается в пределах нормы и только в 11% он превышает 10 000. Ограниченность процесса, малая связь с общим крово- и лимфообращением является причиной нормального лейкоцитоза при гонорее. Когда условия всасывания лучше (в послеродовом периоде, при генерализации процесса), отмечается высокий лейкоцитоз. Наиболее значительный лейкоцитоз наблюдается в тех случаях, когда имеется комбинация гонорейных пиосальпинксов с перипараметритами, что можно объяснить смешанной инфекцией. В противоположность гонорейным аднекситам, параметриты, как заболевания, не характерные для гонореи, дают высокие цифры лейкоцитоза (12 000-20 000 и выше).

В гемограмме крови наибольшее практическое значение при гонорее имеют изменения количества лимфоцитов и эозинофилов. Эозинофилию считают характерной особенностью крови гонорейных больных. Ланге наблюдал значительную эозинофилию (15-20%) при гонорейных эндометритах а аднекситах. А. В. Файнштейн, изучая морфологические изменения крови при воспалениях придатков различной этиологии, нашел, что только при гонорейных аднекситах встречается эозинофилия (4,5-12%). Увеличение эозинофилов указывает на защитную реакцию организма, которая наступает, по-видимому, быстрее, чем при других инфекциях. Эозинофилия в крови, как признак аллергического состояния, может наступить и после введения гонококковой вакцины, поэтому исследование крови на лейкоцитарную формулу следует производить до вакцинации, а не наоборот. По Е. А. Селькозу, эозинофилы появляются при местном лечении в выделениях на третьи-пятые сутки и служат признаком неосложненного течения гонореи, они нейтрализуют эндотоксины.

Лимфоцитоз в крови при гонорее (свыше 25%) находили М. А. Теребинская-Попова, Л. Л. Окинчиц, А. И. Петченко и др. В остром периоде и при обострениях гонореи, в особенности при пиосальпинксах или пельвеоперитонитах, ни лимфоцитоза, ни эозинофилии не бывает; наоборот, наблюдается кратковременная лимфопения, снижение числа или исчезновение эозинофилов. С прекращением острых воспалительных явлений лимфопения переходит в лимфоцитоз, увеличивается количество эозинофилов. С этими оговорками можно считать, что лимфоцитоз и эозинофилия являются частыми и характерными спутниками гонореи. Мы находили лимфоцитоз при женской гонорее в 70-73,3%, а эозинофилию - в 45-60% случаев.

Реакция оседания эритроцитов . Значительное ускорение дает острая гонорея верхнего отдела гениталий; уретриты и эндоцервицита даже с обильным гнойным отделяемым не дают заметного ускорения РОЭ. При гонорее придатков чаще наблюдается ускорение реакции; в этих случаях она может помочь диагностике, особенно при сопоставлении с лейкоцитозом. Триада - нормальный лейкоцитоз, ускоренная реакция оседания эритроцитов, положительная реакция на гоновакцину - позволяет ставить предположительный диагноз гонореи R тех случаях, когда гонококки длительное время не обнаруживаются.

Дополнительный метод исследования . Применяется в том случае, когда гонококков обнаружить не удается, а клиническая картина подозрительна на гонорею, а также как критерий качества терапии после ее окончания. Используют определенные методы воздействия на организм в целом и мочеполовой аппарат (главным образом на мочеиспускательный канал), что ведет к обострению имеющегося воспалительного процесса. После проведения провокации у больного в течение 3 дней берут материал для исследования на содержание гонококков. Применяют следующие виды провокации.

1. 
   Алиментарная - назначение больному острой и соленой пищи, пива, в состав которого входит хмель, содержащий лопулин, выводящийся из организма преимущественно почками. Проходя через мочеиспускательный канал, он раздражает его слизистую оболочку.
2. 
   Иммунобиологическая - внутримышечное введение 0,5 мл (500 млн. микробных тел) гонококковой вакцины. В последнее время провокацию с помощью гоновакцины комбинируют с внутримышечным введением 50-200 МПД пирогенала или продигиозана. Женщинам в стационарных условиях гоновакцину в дозе 50-100 млн. микробных тел вводят в шейку матки.
3. 
   Механическая - введение в мочеиспускательный канал прямого бужа, размер которого соответствует размеру наружного отверстия мочеиспускательного канала. Вместо бужа можно использовать тубус уретроскопа Валентина, особенно в тех случаях, когда при дальнейшем исследовании необходимо сделать уретроскопию. Простерилизованный и охлажденный буж смазывают глицерином и вводят на 10 мин в мочеиспускательный канал, мужчинам - в передний его отдел. Затем производят легкий массаж мочеиспускательного канала на буже с целью получения секрета желез мочеиспускательного канала (рис. 13).
4. 
   Химическая - введение в мочеиспускательный канал химических раздражающих веществ, чаще серебра нитрата (3-4 мл 0,5-1 % раствора у мужчин, 3-4 мл 1-2 % раствора - у женщин; 3-5 % раствор для смазывания канала шейки матки). Для раздражения слизистой оболочки шейки матки можно использовать раствор Люголя. Мазки после химической провокации лучше брать спустя 2-3 дня. В первые дни в выделениях из мочеиспускательного канала и канала шейки матки обнаруживают много
   эпителиальных клеток отторженной слизистой оболочки, что часто затрудняет микроскопическое исследование (рис. 14).
5. 
   Физиотерапевтическая, или термическая, - использование диатермии, реже - интравагинальных грязевых тампонов. Абдоминально-вагинально-сакральную диатермию назначают женщинам ежедневно по 30-40 мин в течение 3 дней. Мазки берут спустя 2 ч после каждой процедуры.
6. 
   Физиологическая - взятие мазка у женщин из канала шейки матки во время менструации и в течение 3 дней после нее.

Рис. 13. Массаж мочеиспускательного канала на металлическом буже

Рис. 14. Инсталляция раствора в мочеиспускательный канал
На практике чаще всего используют комбинированную провокацию.

Мы считаем наиболее удачными комбинации: иммунобиологической и механической провокации - у мужчин; иммунобиологической, термической и физиологической - у женщин.

Первую провокацию обычно проводят спустя неделю после окончания лечения, следующую - через месяц.

Следует отметить, что отрицательные результаты провокации не всегда могут служить неоспоримым критерием излеченности.

Производится при подозрении на сифилис в серонегативный первичный период в случаях, когда при исследовании тканевой жидкости поверхности шанкра не выявлены бледные трепонемы или когда из-за фимоза исследование ее невозможно. Данную манипуляцию производят также у тех больных, у которых к моменту обращения их к врачу наступила эпителизация эрозивного шанкра.

Исследуют регионарный склераденит, кожу над которым обрабатывают раствором йода спиртовым 5 %. Затем шприцем емкостью 2 или 5 мл с хорошо притертым поршнем и короткой толстой иглой делают прокол в центре бубона по его длинной оси на глубину 1-1,5 см. Производят энергичный массаж узла с постепенным извлечением из него иглы и поднятием поршня.

Если игла была введена правильно, то в пунктате должны быть лимфоциты.

Взятую таким способом жидкость исследуют под микроскопом в темном поле зрения (см. № 68).

При наличии сифилиса и правильной технике выполнения пункции бледную трепонему обнаруживают в 80-85 % случаев.
118. Пункция поясничная

Пункция поясничная, или взятие спинномозговой жидкости, является малым оперативным вмешательством и поэтому должна проводиться в условиях строгого соблюдения правил асептики и антисептики. Для ее проведения необходимо иметь стерильный материал: салфетки, шарики из ваты, раствор Люголя, этиловый спирт 96 %, пинцет или палочки, клеол, специальные простерилизованные кипячением пункционные иглы с мандренами. Диаметр иглы 1,5-0,4 мм, длина -8-12 см. Лучше пользоваться иглой диаметром 0,5-0,6 мм, что уменьшает травматичность процедуры. Поясничную пункцию делают в положении больного сидя или лежа . Мы считаем более удобным первый вариант. Полуобнаженного больного усаживают на край стола или лучше на высокую тумбочку. Под ноги ставят высокий табурет с таким расчетом, чтобы колени были максимально приближены к животу. Больного просят сложить руки на животе, голову наклоняют вперед так, чтобы подбородок касался груди, при этом спина выгибается в виде дуги, туловище не должно быть наклонено вниз. При таком положении остистые отростки позвонков максимально раздвигаются, оставляя место для введения иглы. Место прокола выбирают между IV и V или III и IV поясничными позвонками. Палочкой с намотанной на ее конец ватой, смоченной в растворе Люголя, проводят горизонтальную линию, соединяющую верхние края гребней подвздошных костей (линия Якоби). Пересечение этой линии с вертикальной линией, проходящей через середину остистых отростков, и будет соответствовать месту прокола (рис. 15). При прощупывании выявляют незначительное западение. В этом месте ногтем ставят знак в виде креста (место прокола). Врач тщательно моет руки с мылом, высушивает стерильными тампонами, смазывает раствором Люголя и тщательно протирает этиловым спиртом. Кожу больного смазывают раствором Люголя или раствором йода спиртовым 5 %, затем энергично протирают этиловым спиртом и высушивают стерильным марлевым тампоном. Внутрикожно вводят до образования «лимонной корки» 0,5-1 мл 1 % раствора новокаина с целью анестезии, особенно больным с лабильной нервной системой . Через 1-2 мин пункционную иглу вводят непосредственно под остистый отросток IV поясничного позвонка по средней линии, медленно продвигая ее вперед и несколько вверх. Правой руке врача, которая является как бы направляющей, помогает левая, проталкивая иглу вперед. Продвинув иглу на 4-5 см, врач ощущает небольшой хруст (прокол желтой связки), после этого извлекает мандрен, и из иглы начинает вытекать спинномозговая жидкость. В норме она прозрачная, вытекает каплями, которые можно сосчитать. Если жидкость вытекает струей, то это свидетельствует о повышенном давлении в спинномозговом канале. 3-4 мл жидкости собирают в две стерильные пробирки и направляют в лабораторию на исследование. Ватой, смоченной этиловым спиртом, придерживают кожу у основания иглы и медленными винтообразными движениями извлекают ее. Место прокола смазывают раствором йода спиртовым 5 % и накладывают стерильную коллоидную повязку.

Рис. 15. Схема спинномозговой пункции

Исследование спинномозговой жидкости является необходимым условием для правильной диагностики, выбора тактики лечения и оценки его эффективности при сифилисе. К сожалению, многие врачи недооценивают практическую важность этого метода. В спинномозговой жидкости определяют содержание белка (норма -до 0,4 %), подсчитывают количество форменных элементов (норма - менее 8 клеток),

проводят реакции: Нонне - Апельта и Панди (норма ++), одну из коллоидных (лучше с золота хлоридом), Вассермана в разведениях 0,1; 0,25; 0,5 при наличии в пробирке 2,5 мл жидкости. По возможности ставят реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) и реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ). Реакцию Вассермана (с кардиолишшовым и липидным антигенами), РИФ и РИТ проводят общепринятыми методами (см. №119, 121, 123, 124).
119. Реакции Панди и Нонне - Апельта

В качестве реактива для проведения реакции Панди используют надосадочную прозрачную жидкость, которую получают при сильном взбалтывании 100 г жидкой карболовой кислоты с 1000 мл дистиллированной воды. Для получения осадка и прозрачной жидкости (реактива) данную смесь помещают сначала на 3-4 ч в термостат , а затем 2-3 дня выдерживают при комнатной температуре.

Часовое или предметное стекло кладут на темную бумагу и наносят на него 2-3 капли реактива, затем 1 каплю спинномозговой жидкости. При помутнении капли или появлении нитевидной мути по ее периферии реакцию считают положительной.

Для проведения реакции Нонне - Апельта необходимы чистые пробирки, насыщенный раствор аммония сульфата, дистиллированная вода, темная бумага. Насыщенный раствор аммония сульфата готовят следующим образом: в колбу емкостью 1000 мл помещают 0,5 г химически чистого нейтрального аммония сульфата, затем наливают 100 мл дистиллированной воды, подогретой до 95 °С, взбалтывают до полного растворения соли и оставляют на несколько дней при комнатной температуре. Спустя 2-3 дня раствор фильтруют и определяют рН. Реакция должна быть нейтральной.

В пробирку наливают 0,5-1 мл полученного раствора и осторожно по стенке пробирки добавляют такое же количество спинномозговой жидкости. Через 3 мин оценивают результат. Появление беловатого кольца свидетельствует о положительной реакции. Затем содержимое пробирки взбалтывают, определяют степень помутнения, сравнивая с пробиркой, содержащей дистиллированную воду. Результаты реакции оценивают на фоне черной бумаги.
120. Реакция Борде - Жангу

Ценный диагностический тест при выявлении хронической гонореи среди лиц, страдающих хроническими воспалительными заболеваниями мочеполовой системы. По данным литературы, при правильном использовании этого метода выявляют до 80 % случаев гонореи, не обнаруженной бактериоскопическим или бактериологическим методом.

Реакция Борде - Жангу может быть следовой в результате перенесенного ранее заболевания или применения гоновакцины с диагностической (иммунобиологический метод провокации), а также лечебной (лечение хронических воспалительных процессов мочеполовой системы у женщин по Бакшееву) целью. Поэтому перед ее проведением необходимо тщательно собрать анамнез,

Реакция может быть и ложноположительной при введении молока, использовании в лечебных целях пирогенала.

Следовательно, положительная реакция Борде - Жангу не служит бесспорным доказательством наличия гонококковой инфекции, как и отрицательная не может быть свидетельством отсутствия гонореи. Однако положительные результаты ее в течение длительного времени должны нацелить врача на поиск очага гонококковой инфекции в организме.

В качестве антигена используют убитую гонококковую культуру, содержащую 3-4 млрд. микробных тел в 1 мл. Гонококковый антиген консервируют раствором формальдегида и разливают в ампулы по 1- 5 мл. Не вскрытые ампулы пригодны в течение 6 мес, вскрытые можно сохранять 2-3 дня в стерильной пробирке в холодильной камере при температуре 3-5 °С,

Реакцию связывания комплемента Борде - Жангу проводят аналогично реакции Вассермана (см. № 121). Гонококковый антиген разводят изотоническим раствором натрия хлорида соответственно указанному на этикетке ампулы титру. Реакцию проводят чаще всего в объеме 2,5 мл, поэтому к 0,5 мл разведенной 1: 5 испытуемой сыворотки добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл разведенного антигена. Остальные 1,5 мл составляют 1 мл гемолитической системы и 0,5 мл комплемента.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной в разной степени задержки гемолиза в испытуемой сыворотке. В контроле (сыворотка крови здоровых людей) наблюдается полный гемолиз.

В сыворотке крови больных сифилисом находятся реагины и антитела. Реагины обладают свойством вступать в соединения с кардиолипиновым антигеном. Специфические антитела против бледной трепонемы вступают в соединение со специфическими антигенами. Образовавшиеся комплексы антиген - антитело сорбируют добавляемым в реакцию комплементом . Индикацию производят путем введения гемолитической системы (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка).

Для проведения реакции требуются:

а) изотонический раствор натрия хлорида;

б) ультраозвученный трепонемный (хранят в холодильнике при температуре +4 °С) и кардиолипиновый (хранят при комнатной температуре) антигены;

в) комплемент, представляющий собой сыворотку крови, полученной при пункции сердца 5-10 здоровых гвинейских свинок. Может сохраняться в холодильнике в течение 2 мес при условии

г) гемолизин - гемолитическая сыворотка крови кролика, иммунизированная эритроцитами барана с разными титрами (хранят в холодильнике при температуре 4 °С);

д) эритроциты барана, получаемые пункцией яремной вены. Кровь собирают в стерильную банку со стеклянными шариками (для перемешивания), встряхивают 15 мин. Сгустки фибрина отделяют фильтрованием через стерильную марлю. Дефибринированную кровь можно хранить в холодильнике до 5 сут.
Иногда возникает необходимость более длительного хранения крови барана, в связи с чем ее консервируют специальным консервантом (6 г глюкозы, 4,5 г кислоты борной, 100 мл изотонического раствора натрия хлорида), который кипятят на водяной бане по 20 мин в день в течение 3 сут. На 100 мл дефибринированной крови барана требуется 15 мл консерванта. Консервированную таким образом дефибринированную кровь хранят в холодильнике.
Проведению основного опыта предшествует несколько этапов.

1. 
   У больного из локтевой вены берут 5-10 мл крови и обрабатывают сыворотку. У детей кровь можно взять из височной вены или разреза на пятке. Пункцию делают стерильными инструментами, шприц и иглу
   предварительно промывают изотоническим раствором натрия хлорида.

Не следует проводить исследование у больных с повышенной температурой тела, после травмы, операции, наркоза, перенесенных недавно инфекционных заболеваний, у женщин во время менструации, у беременных (в последние 10 дней беременности), рожениц (в первые 10 дней после родов), а также новорожденных (в первые 10 дней жизни).

Полученную кровь в стерильной пробирке помещают на 15-30 мин в термостат при температуре 37 °С. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки стерильной стеклянной палочкой и ставят в холодильник на сутки. Отделившуюся прозрачную сыворотку (над сгустком) отсасывают пастеровской пипеткой с помощью резиновой груши либо осторожно сливают в другую стерильную пробирку и инактивируют на водяной бане в течение 30 мин при температуре 56 °С. Приготовленную таким образом для опыта сыворотку можно хранить в холодильнике до 5-6 дней.

1. 
   Антигены разводят соответственно способу и титру, указанным на этикетке.
2. 
   Приготавливают гемолитическую систему. Для этого дефибринированную кровь или эритроциты барана в количестве , необходимом для проведения реакции, центрифугируют, плазму осторожно отделяют, а осадок промывают 5-6 объемами изотонического раствора натрия хлорида до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет совершенно бесцветной. Из осадка готовят 3 % взвесь эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру.

1. 
   Сухой комплемент разводят изотоническим раствором натрия хлорида в пропорции 1:10, нормальную инактивированную сыворотку человека- 1:5.

Пробирки помещают на 45 мин в термостат, после чего их проверяют. Гемолиза не должно быть ни в одной пробирке.

Комплемент в разведении 1:10 разливают в 10 пробирок 1-го ряда штатива в дозах: 0,1, 0,16, 0,2,0,24, 0,3, 0,36,0,4,0,44, 0,5 и 0,55 мл. К содержимому каждой пробирки добавляют изотонический раствор натрия хлорида до 1 мл и тщательно перемешивают. По 0,25 мл смеси из каждой пробирки переносят в соответствующие пробирки 2-го и 3-го рядов. Штатив с пробирками встряхивают, в 3-й ряд пробирок добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, вновь встряхивают и помещают на 45 мин в термостат при температуре 37 °С. Нормальную сыворотку крови человека, разведенную изотоническим раствором натрия хлорида в пропорции 1:5, по 0,25 мл разливают во все 30 пробирок.

Антиген I (трепонемный ультраозвученный), разведенный по титру изотоническим раствором натрия хлорида, по 0,25 мл добавляют в 10 пробирок 1-го ряда; антиген II (кардиолипиновый в том же разведении и в том же количестве) - в 10 пробирок 2-го ряда. В 10 пробирок 3-го ряда приливают по 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида, оставшиеся 0,25 мл выливают. После инкубации в термостате в 20 пробирок (1-го и 2-го ряда) добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, встряхивают и повторно помещают в термостат на 45 мин.

Через 45 мин определяют рабочую дозу комплемента, то есть титр его с надбавкой в пределах 15-20 %.

Титром комплемента считают его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов барана в присутствии антигена и нормальной сыворотки крови человека.

Основной опыт заключается в том, что каждую испытуемую инактивированную сыворотку, разведенную в пропорции 1: 5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки. В первую пробирку добавляют 0,25 мл антигена I, во вторую - 0,25 мл антигена II, в третью (контроль) -0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Во все пробирки добавляют также по 0,25 мл разведенного до рабочей дозы комплемента. Все пробирки помещают на 45 мин в термостат, затем в них добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, встряхивают и ставят в термостат на 45-50 мин. Результат опыта регистрируют после наступления полного гемолиза в контрольных пробирках.

Результаты реакции оценивают плюсами: полная задержка гемолиза (резкоположительная реакция) ++++, значительная (положительная реакция) +++, частичная (слабоположительная реакция) ++, незначительная (сомнительная реакция) - ±, отсутствие задержки гемолиза (отрицательная реакция) -.

При количественном методе проведения реакции Вассермана опыт ставят с уменьшающимися объемами сыворотки, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида.
Схема проведения основного опыта реакции Вассермана

Клиническое значение реакции Вассермана трудно переоценить. Ее проводят всем больным до начала лечения, но особое значение она имеет при скрытом сифилисе, поражении внутренних органов и нервной системы.

Результаты реакции Вассермана характеризуют качество проведенного лечения , что дает основание в определенные сроки снимать с учета лечившихся больных.

При первичном сифилисе реакция Вассермана положительная обычно в конце 6-й недели с момента заражения; при вторичном свежем сифилисе она положительная почти в 100 % случаев, при вторичном рецидивном -в 98-100%; третичном активном - в 85%; третичном скрытом - в 60 % случаев.

Реакцию Вассермана проводят двукратно всем беременным, больным с соматическими, нервными, психическими и кожными болезнями, а также декретируемым контингентам населения. В то же время к.положительным и слабоположительным результатам реакции следует относиться критически, так как они могут быть в конце беременности и после родов, при гипертиреозе, малярии, проказе, распаде злокачественной опухоли, инфекционных заболеваниях, коллагенозах и др. Поэтому при наличии клинических проявлений болезни их следует учитывать, наряду с данными бактериоскопии, в первую очередь.

Вместе с тем имеются факторы , которые могут исказить истинный характер полученных результатов реакции Вассермана: плохо вымытая лабораторная посуда (следы кислоты и щелочи в пробирках), длительное хранение крови, взятой для исследования, употребление больными жиров и алкоголя перед обследованием, период менструации и др.