Évaluation des résultats des études sérologiques et virologiques. Détermination des indications des études bactériologiques, virologiques, sérologiques lors du décryptage de l'étiologie du cancer et évaluation des résultats

Diagnostic en laboratoire des infections virales

Le diagnostic étiologique des maladies virales est réalisé méthodes virologiques, virusoscopiques, sérologiques et génétiques moléculaires. Les trois dernières méthodes peuvent être utilisées comme méthodes de diagnostic express.

Méthode de diagnostic virologique.

Le but ultime de la méthode est d’identifier les virus selon leur espèce ou leur variante sérologique. La méthode virologique comprend plusieurs étapes : 1) sélection du matériel de recherche ; 2) traitement de matériel contenant des virus ; 3) contamination des systèmes vivants sensibles par des matériaux ; 4) indication de virus dans les systèmes vivants ; 5) titrage de virus isolés ; 6) identification des virus dans les réactions immunitaires.

1. Sélection du matériel pour la recherche. Elle est réalisée aux premiers stades de la maladie, sous réserve des règles qui empêchent la contamination du matériel par une microflore étrangère et l'infection du personnel médical. Pour éviter l'inactivation des virus pendant le transport, le matériel est placé dans un milieu de transport viral (VTS) constitué d'une solution saline équilibrée, d'antibiotiques et d'albumine sérique. Le matériau est transporté dans un conteneur spécial avec isolation thermique et sacs en plastique fermés contenant de la glace. Si nécessaire, le matériau est stocké à -20˚C. Chaque échantillon de matériel destiné à la recherche doit être marqué et étiqueté indiquant le nom du patient, le type de matériel, la date de prélèvement, le diagnostic clinique détaillé et d’autres informations.

Selon la nature de la maladie, le matériel de recherche peut être : 1) des lavages de la partie nasale du pharynx et un frottis du pharynx ; 2) liquide céphalo-rachidien ; 3) selles et prélèvements rectaux ; 4) du sang ; 5) urines ; 6) liquide provenant des cavités séreuses ; 7) frottis de la conjonctive ; 8) contenu des vésicules ; 8) matériau en coupe.

Pour obtenir lavage de l'oropharynx utilisez 15-20 ml de BTS. Le patient se gargarise soigneusement avec le VTS pendant 1 minute et récupère le rinçage dans un flacon stérile.

Écouvillonnage au fond de la gorge prendre avec un coton-tige stérile en appuyant sur la racine de la langue avec une spatule. Le tampon est placé dans 2-3 ml de VTS, rincé et pressé.

Liquide cérébro-spinal obtenu par ponction vertébrale. 1 à 2 ml de liquide céphalo-rachidien sont placés dans un récipient stérile et livrés au laboratoire.

Les échantillons de selles sont collectés dans un délai de 2 à 3 jours dans des flacons stériles. Une suspension à 10 % est préparée à partir du matériau résultant en utilisant la solution de Hanks. La suspension est centrifugée à 3000 tr/min, le surnageant est récupéré, des antibiotiques y sont ajoutés et placés dans un récipient stérile.

Le sang obtenu par ponction veineuse dans un volume de 5 à 10 ml est défibriné par ajout d'héparine. Le sang total n’est pas congelé et aucun antibiotique n’est ajouté. Pour obtenir du sérum, les échantillons de sang sont conservés dans un thermostat à 37°C pendant 60 minutes.

Le liquide des cavités séreuses est obtenu par ponction à raison de 1 à 2 ml. Le liquide est utilisé immédiatement ou conservé congelé.

Un frottis de la conjonctive est prélevé avec un écouvillon stérile et placé dans un VTS, après quoi le matériel collecté est centrifugé et congelé.

Contenu des vésicules aspiré avec une seringue avec une aiguille fine et placé dans le VTS. Le matériel est envoyé au laboratoire sous forme de frottis séchés sur des lames de verre ou dans des capillaires ou ampoules stériles scellés.

Matériel sectionnel sont sélectionnés le plus tôt possible, dans le respect des règles d'asepsie. Des ensembles distincts d'instruments stériles sont utilisés pour collecter chaque échantillon. La quantité de tissu prélevée est de 1 à 3 g, placée dans des flacons stériles. Dans un premier temps, des échantillons sont prélevés sur les organes extracavitaires (cerveau, ganglions lymphatiques, etc.). Les tissus de la cavité thoracique sont collectés avant d'ouvrir la cavité abdominale. Les échantillons de tissus obtenus sont broyés dans un mortier additionné de sable stérile et d'une solution stérile de chlorure de sodium, après quoi le matériau est centrifugé. Le surnageant est collecté dans des flacons et des antibiotiques sont ajoutés. Le matériel destiné à la recherche virologique est utilisé immédiatement ou conservé à -20˚C.

2. Traitement du matériel contenant des virus. Elle est réalisée dans le but de libérer le matériau de la microflore bactérienne qui l'accompagne. Pour cela, des méthodes physiques et chimiques sont utilisées. Méthodes physiques : 1) filtration à travers divers filtres bactériens ; 2) centrifugation. Méthodes chimiques : 1) traitement du matériel à l'éther en cas d'isolement de virus ne possédant pas de supercapside ; 2) ajouter un mélange d'heptane et de fréon au matériau ; 3) administration d'antibiotiques (pénicilline - 200-300 U/ml ; streptomycine - 200-500 mcg/ml ; nystatine - 100-1000 U/ml).

Animaux de laboratoire. On utilise des souris blanches, des cobayes, des hamsters, des lapins... Les souris blanches sont les plus sensibles à un grand nombre de types de virus. La méthode d'infection des animaux est déterminée par le tropisme du virus par rapport aux tissus. L'infection cérébrale est utilisée pour isoler des virus neurotropes (virus de la rage, poliovirus, etc.). L'infection intranasale est réalisée lorsque des agents pathogènes d'infections respiratoires sont isolés. Les méthodes d'infection intramusculaires, intraveineuses, intrapéritonéales, sous-cutanées et autres sont largement utilisées. Les animaux malades sont euthanasiés avec de l'éther, ouverts et le matériel est collecté dans les organes et les tissus.

Embryons de poulet. Largement disponible et facile à utiliser. Des embryons de poulet âgés de 5 à 14 jours sont utilisés. Avant l'infection, les embryons de poulet sont ovoscopiques : leur viabilité est déterminée, le bord du sac aérien et l'emplacement de l'embryon sont marqués sur la coquille (l'« œil noir » de l'embryon). Le travail avec les embryons de poulet s'effectue dans une boîte stérile avec des instruments stériles (pincettes, seringues, ciseaux, lance, etc.). Après avoir terminé un fragment de travail, les outils sont immergés dans de l'alcool éthylique à 70 % et brûlés avant la prochaine manipulation. Avant l'infection, la coquille d'un embryon de poulet est essuyée avec un tampon alcoolisé brûlant et une solution alcoolique d'iode. Le volume du matériel de test injecté dans l'embryon est de 0,1 à 0,2 ml. Pour isoler les virus d'un matériau, au moins 4 embryons de poulet sont utilisés.

Infection dans la cavité allantoïdienne. L'œuf de poule est placé verticalement, le sac aérien vers le haut. Au centre du pôle émoussé de l'œuf au-dessus du sac aérien, la coquille est percée, une aiguille pour injection intramusculaire est insérée à 2-3 mm sous le bord du sac aérien et le matériel à tester est injecté avec une seringue à tuberculine. La perforation de la coque est recouverte de paraffine fondue ou d'un sparadrap.

Infection dans la cavité amniotique. Une fenêtre mesurant 1x1 cm est découpée au-dessus du sac aérien d'un œuf situé verticalement et une partie de la membrane chorion-allantoïque au-dessus du corps de l'embryon est soigneusement retirée. Le matériel de test y est injecté avec une pince à épiler à l'aide d'une seringue à tuberculine. L'amnios est ramené à sa position initiale en relâchant la pince à épiler. Le trou dans la coque est recouvert d'un pansement adhésif.

Infection de la membrane chorion-allantoïque. Un morceau de coquille est découpé au-dessus de la chambre à air d’un œuf positionné verticalement, créant ainsi une fenêtre. Ensuite, la membrane située sous la coque est décollée, exposant une section de la membrane chorion-allantoïque sur laquelle le matériau d'essai est appliqué. Le trou dans la coque est scellé avec du ruban adhésif.

Infection dans le sac vitellin. L'œuf est pondu horizontalement de manière à ce que le corps de l'embryon soit situé en dessous et le jaune au-dessus. Grâce à une perforation de la coquille dans la zone du sac aérien, une aiguille pour injection intramusculaire est insérée le long de l'axe central de l'œuf jusqu'à une profondeur de 2/3 de la longueur de l'aiguille et le matériel d'essai est injecté avec une seringue. Le trou dans la coque est scellé avec du ruban adhésif.

Après infection, les embryons sont incubés dans un thermostat avec l’extrémité émoussée tournée vers le haut. La température et la durée d'incubation dépendent des propriétés biologiques du virus isolé. À la fin de l'incubation, les embryons sont refroidis à +4 ° C pendant 16 à 18 heures. Après cela, l'embryon de poulet est ouvert stérilement en découpant un trou dans la coquille au-dessus du sac aérien, au-dessus de la bordure marquée. À l'aide d'une pipette ou d'une seringue Pasteur, le liquide allantoïdien puis amniotique est aspiré, la membrane chorion-allantoïque est coupée pour étude et le contenu restant de l'œuf est retiré dans une boîte de Pétri. Les liquides allantoïques et amniotiques sont utilisés pour indiquer les virus.

Cultures d'organes. Il s’agit de sections d’organes correctement préparées qui conservent in vitro leur structure et leur fonction pendant plusieurs jours, voire plusieurs semaines. Les cultures d'organes sont cultivées à la surface d'un milieu de culture liquide à l'aide d'un « radeau » ou d'une « plateforme ». L'infection d'une culture d'organe est réalisée en introduisant des morceaux d'organe ou de tissu dans un tube à essai contenant le matériel à tester. L'adsorption du virus est réalisée pendant 1 à 2 heures à température ambiante. Ensuite, le matériel étudié est drainé, les fragments de l'organe ou du tissu sont lavés dans la solution de Hanks, placés dans un récipient pour la culture, un milieu nutritif est ajouté et conservé dans un thermostat. La collecte du matériel pour la détection du virus dans la culture tissulaire commence le 2ème jour de culture.

Cultures cellulaires. Une culture cellulaire est une population du même type de cellules dans un corps animal ou humain, cultivée dans des conditions artificielles et destinée à la culture de virus. En fonction de leur durée de vie, les cultures cellulaires sont divisées en : 1) primaires ; 2) demi-feuille ; 3) transplantable.

Cultures de cellules primaires obtenus à partir de tissus animaux et humains par leur désintégration enzymatique. Des morceaux de tissu sont placés dans une solution de trypsine à 0,25 % à une température de 37 °C et agités périodiquement. En conséquence, les cellules des tissus se séparent les unes des autres. Des portions de cellules sont collectées au fur et à mesure qu'elles sont séparées, centrifugées, la trypsine est drainée, un milieu de croissance est ajouté et les cellules y sont suspendues. Les cultures de cellules primaires peuvent subir jusqu'à 10 divisions in vitro, sont très sensibles à de nombreux virus, peuvent être obtenues en grandes quantités et sont sûres en termes oncogènes. L'inconvénient des cultures primaires est l'intensité de travail et la durée de production importantes, ainsi que la contamination possible par des virus latents. Les cultures de cellules primaires comprennent des cellules rénales embryonnaires humaines, des macaques rhésus, des embryons de porc et des fibroblastes d'embryons de poulet.

Cultures cellulaires semi-continues sont des cellules diploïdes du même type capables de subir jusqu'à 100 divisions in vitro, tout en conservant l'ensemble diploïde d'origine de chromosomes. Les cultures cellulaires semi-continues incluent des fibroblastes embryonnaires humains (Fig. 2). Ces cellules sont extrêmement exigeantes en termes de conditions de culture, leur utilisation est donc limitée dans les laboratoires de virologie.

Cultures cellulaires continues– il s’agit du même type de tumeur ou de cellules normales d’humains et d’animaux avec un caryotype altéré, capables de croître de manière illimitée dans des conditions in vitro. Les cultures cellulaires continues sont faciles à cultiver et sont donc largement utilisées dans le diagnostic en laboratoire des maladies virales chez l'homme. Les cultures cellulaires transplantables comprennent les lignées HeLa (cellules de carcinome cervical humain), KV (cellules de carcinome oral humain), Vero (cellules rénales de singe vert), SPEV (cellules rénales embryonnaires de porc), etc.

La croissance des cultures cellulaires, quel que soit leur type, est réalisée dans des conditions stériles dans des récipients en verre plats spéciaux - des matelas, dans lesquels le milieu nutritif est ajouté. Au bas du matelas, les cellules, lorsqu’elles se multiplient, forment une monocouche.

Pour la culture de cultures cellulaires, des milieux nutritifs spéciaux sont utilisés, contenant des quantités physiologiques d'acides aminés, de glucides, de sels minéraux et ayant un pH de 7,2 à 7,4. Outre les nutriments, le milieu contient un indicateur qui change la couleur du milieu à mesure que le pH s'écarte de la valeur optimale. Les plus largement utilisés lorsqu'on travaille avec des cultures cellulaires sont : le milieu 199, milieu d'Eagle. Le milieu 199 comprend 60 composants et est utilisé pour la culture de cellules trypsinisées continues et primaires. Le milieu Eagle contient un ensemble minimum d'acides aminés (13) et de vitamines (8). Il est utilisé pour la culture de cellules diploïdes et continues.

La culture cellulaire doit être réalisée dans des conditions aseptiques, c'est pourquoi des antibiotiques (par exemple la pénicilline et la streptomycine) sont ajoutés aux milieux de culture.

4. Indication des virus dans les systèmes vivants. L'indication de virus est la détection de virus dans le matériel d'essai sans établir leur appartenance à la famille, au genre, à l'espèce ou au sérovariant.

Indication des virus chez les animaux de laboratoire. La présence de virus dans l'organisme est principalement indiquée par l'apparition de symptômes de maladie ou la mort de l'animal. Des échantillons d'organes et de tissus affectés sont prélevés sur un animal mort ou pré-euthanasie avec de l'éther, placés dans un mortier en porcelaine, une solution saline est ajoutée et broyée avec du sable. La suspension résultante est centrifugée pour sédimenter les détritus tissulaires. Dans le liquide surnageant, les virus sont identifiés par des antigènes hémagglutinants, fixateurs du complément ou autres.

Indication de virus sur embryons de poulet. Les virus sont détectés dans le liquide amniotique et allantoïdien grâce à la réaction d'hémagglutination (HRA). Lorsqu'un embryon de poulet est infecté, des plaques ou des pustules, qui sont des lésions spécifiques du virus, se trouvent souvent sur la membrane chorion-allantoïque. L'indication des virus dans la membrane chorion-allantoïque est réalisée lors de réactions d'hémagglutination ou de fixation du complément (CFF). Pour ce faire, la coquille est broyée dans un mortier, une suspension est préparée, qui est centrifugée pour sédimenter les détritus tissulaires, et le surnageant est examiné au RGA ou au RSC.

Indication des virus dans les cultures d'organes et de cellules réalisée selon : 1) l'effet cytopathique des virus (CPE) ; 2) la formation d'inclusions intracellulaires ; 3) dans la réaction d'hémagglutination ; 4) par formation de plaque ; 5) par test de couleur ; 6) par réaction d'hémadsorption.

DPC– ce sont des changements morphologiques dans la culture des organes et des cellules qui surviennent lors de la reproduction des virus dans les cellules. Les virus responsables de la DPC sont appelés cytopathogènes. La nature du CPE dépend des propriétés biologiques des virus, de la dose du virus, des propriétés des cellules et de leurs conditions de culture. La CPD des virus peut se manifester par une nécrose, une formation de grappes, une formation de symplasto et de syncytium, une dégénérescence des cellules rondes, une prolifération cellulaire et une destruction focale.

Avec le CPD nécrotique des virus polio, Coxsackie, ECHO, la plupart des cellules sont complètement détruites, les cellules restantes sont ridées (pycnose du noyau et de la membrane cytoplasmique, vacuolisation), elles se caractérisent par biréfringence - forte luminescence en microscopie.

Le CPD selon le type de formation de clusters est caractéristique des adénovirus, dans lesquels les cellules s'arrondissent, s'agrandissent et fusionnent partiellement les unes avec les autres pour former des amas en forme de cluster (Fig. 3).

Un syncytium est constitué de cellules reliées par des ponts cytoplasmiques, tandis qu'un symplaste est une grande cellule multinucléée formée à la suite de mitoses incomplètes répétées.

Le CPD des virus selon le type de dégénérescence des cellules rondes se caractérise par un arrondi des cellules et une perte des connexions intercellulaires. Une pycnose, des rides et une destruction cellulaire peuvent également être observées (Fig. 5).

Dans les virus oncogènes, la CPD peut se manifester par la transformation de cellules en cellules malignes, qui s'accompagne d'une prolifération cellulaire intense et de la formation de structures cellulaires multicouches. La CPD de certaines souches de virus de la grippe, de la vaccine et de la variole se manifeste par une destruction focale de la culture cellulaire - des foyers de dommages cellulaires (microplaques) apparaissent sur le fond d'une monocouche généralement préservée.

En l'absence ou en cas de CPE faiblement exprimé, de nouvelles cultures cellulaires sont infectées par le liquide de culture.

Inclusions intracellulaires dans le cytoplasme ou le noyau des cellules se forment lors de la reproduction des virus de la rage, de la variole, de la grippe, de l'herpès, des adénovirus, etc.. Les inclusions intracellulaires sont des accumulations cristallines de virions. Les inclusions sont détectées par microscopie optique à immersion après coloration des verres avec une monocouche Romanovsky-Giemsa, ou par microscopie à fluorescence après traitement à l'orange d'acridine. Lorsqu'elles sont colorées selon Romanovsky-Giemsa, les inclusions virales acquièrent une couleur rose ou rose-lilas. Lorsqu'elles sont colorées à l'acridine orange, les structures d'ADN donnent une lueur verte et les structures d'ARN donnent une lueur rouge-orange. Actuellement, la détection des inclusions intracellulaires est réalisée lors du diagnostic de la rage (corps de Babes-Negri) (Fig. 6). Auparavant, des corps de Guarneri avaient été identifiés dans la variole.

Formation de plaques. Les plaques sont des foyers de cellules monocouches infectées par un virus primaire détruites et situées sous une couche de gélose. Les plages sont détectées en colorant la culture avec du rouge neutre, qui est soit inclus dans l'enrobage de gélose, soit ajouté immédiatement avant l'enregistrement des résultats. Les plaques étant constituées de cellules mortes qui ne perçoivent pas le colorant, elles sont donc visibles sous forme de taches claires sur fond d'une monocouche rose-rouge de cellules vivantes. La formation de plaques est enregistrée pour l'analyse quantitative de l'activité infectieuse des cellules.

Test de couleur. Les milieux 199 et Igla, dans lesquels sont cultivées les cultures cellulaires, ont une couleur pourpre, pH = 7,2-7,4 et contiennent un indicateur qui change la couleur du milieu lorsque le pH change. Lorsque des cultures cellulaires non infectées par le virus sont cultivées dans ces milieux, en raison de la libération de produits métaboliques acides par les cellules, la couleur du milieu passe à l'orange. Les cellules infectées par le virus, à la suite de la suppression du métabolisme par la reproduction virale, ainsi qu'à la suite du CPE des virus, sont détruites, le cytoplasme alcalin des cellules pénètre dans le milieu sans changer de couleur (le milieu reste rouge) .

Réaction d'hémagglutination (HRA) repose sur la capacité de certains virus contenant de l’agglutinine sur leur enveloppe externe à coller (agglutiner) les globules rouges de certaines espèces animales. Pour réaliser la RGA, du matériel acellulaire contenant un virus (liquide allantoïque ou amniotique, surnageant de culture tissulaire) est utilisé. Le liquide contenant le virus est mélangé avec 0,5 ml de solution isotonique de chlorure de sodium et 0,5 ml d'une suspension à 1 % de globules rouges lavés, puis incubé à 37°, 20° ou 4°C pendant 30 à 60 minutes. Avec un contrôle négatif, le développement d'une agglutination dans l'expérience indique la présence d'un virus dans le liquide testé. Le contrôle est un mélange de 0,5 ml de globules rouges avec un volume égal de solution isotonique de chlorure de sodium ne contenant pas le virus.

Réaction d'hémadsorption (RGads) permet de détecter les virus contenant de l'hémagglutinine dans les cultures cellulaires avant le développement du CPE (Fig. 7). L'hémadsorption n'est observée que si l'hémagglutinine du virus est présente sur la membrane cytoplasmique des cellules en culture. Le Rgads est réalisé en ajoutant 0,2 ml d'une suspension de globules rouges à 0,5 % à la culture cellulaire, après quoi les cellules sont conservées pendant 15 à 20 minutes à 37°, 20° ou 4°C (en fonction des propriétés du virus). Ensuite, les tubes sont secoués pour éliminer les érythrocytes non adsorbés et leur accumulation sur des cellules individuelles ou sur la monocouche entière est prise en compte sous un faible grossissement au microscope. L'adsorption des érythrocytes n'est pas observée sur les cellules non infectées par des virus.

5. Titrage des virus isolés - Il s'agit d'une étape obligatoire de la méthode de diagnostic virologique dont le but est de déterminer quantitativement la teneur en particules virales par unité de volume du matériel examiné.

Méthodes de titrage des virus isolés chez les animaux de laboratoire prévoir la détermination de la dose (titre) à laquelle l'agent pathogène provoque la mort de 50 % des animaux infectés ou des symptômes caractéristiques de la maladie. Le titre des virus est exprimé en DL 50 - dose mortelle ou en ID 50 - dose infectieuse.

Titrage de virus isolés d'embryons de poulet et ayant une activité hémagglutinante sont réalisés dans une réaction d'hémagglutination. L'analyse aux rayons X est effectuée dans des tubes à essai ou dans des comprimés spéciaux. Des doubles dilutions sont préparées à partir de matériel contenant du virus dans 0,5 ml de solution isotonique de chlorure de sodium. Ajouter 0,5 ml de suspension de globules rouges dans tous les tubes à essai. Le contrôle est un mélange de 0,5 ml de globules rouges avec le même volume de solution isotonique de chlorure de sodium, qui ne contient pas de virus. En fonction des propriétés du virus étudié, le mélange est incubé dans un thermostat à 37°, 20° et 4°C. Les résultats de la réaction sont pris en compte 30-60 minutes après sédimentation complète des érythrocytes dans le contrôle : (++++) - agglutination intense et rapide des érythrocytes, le sédiment a une forme d'étoile à bords festonnés (« parapluie »); (+++) – le sédiment érythrocytaire présente des lacunes ; (++) – sédiments moins prononcés ; (+) – sédiment floconneux d'érythrocytes, entouré d'une zone de morceaux d'érythrocytes agglutinés et (-) – sédiment d'érythrocytes bien défini (« colonne de pièces de monnaie »), le même que dans le contrôle. Le titre du virus au cours de la RGA est la dilution la plus élevée à laquelle une agglutination des globules rouges est encore observée. Cette dilution est considérée comme contenant une unité hémagglutinante de virus (1 HAU). Les dilutions qui précèdent 1 GAE contiendront 2 fois plus de GAE par rapport à la dilution qui les suit. Par exemple, si 1 GAE correspond à une dilution de 1:64, alors une dilution de 1:32 correspondra à 2 GAE, et les dilutions de 1:16 et 1:8 correspondront respectivement à 4 et 8 GAE. Pour identifier les virus, un titre de virus de 4 GAU est généralement utilisé.

Titrage de virus dans des cultures cellulaires réalisée par CPP, formation de plaque et test de couleur.

Le titre du virus, lorsqu'il est déterminé dans des cultures cellulaires par CPE, correspond à la dilution la plus élevée du matériel contenant le virus dans laquelle le virus est capable de provoquer une CPE dans 50 % des cultures cellulaires infectées. Cette valeur est appelée dose cytopathique tissulaire à 50 % (TCD 50). Le titrage du virus par CPD comprend les étapes suivantes : 1) semis, croissance et sélection de cultures en éprouvette de cellules avec une monocouche formée ; 2) obtenir des dilutions de 10 fois de matériel contenant des virus ; 3) infection de cultures cellulaires avec différentes dilutions du virus ; 4) maintenir les cultures cellulaires dans un thermostat à 37° ; 5) enregistrement des résultats aux jours 5 à 7 selon le système plus (++++) et traitement statistique des résultats. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, il est nécessaire de respecter un certain nombre de règles : a) utilisation d'au moins 4 cultures cellulaires en éprouvette pour l'infection avec 1 dilution du virus ; b) inclusion dans la série de titres de 2 dilutions du virus - en dessous et au dessus du CPE 50.

Le titrage des virus dans les cultures cellulaires basé sur la formation de plaques est l'une des méthodes les plus sensibles et les plus précises pour la détermination quantitative des virus. Cependant, la méthode est techniquement complexe et est principalement utilisée dans la recherche scientifique.

Le titrage des virus dans les cultures cellulaires à l'aide de la méthode de test de couleur vise à déterminer la dilution la plus élevée du matériel contenant le virus à laquelle un changement de couleur se produit dans le milieu contenant une suspension cellulaire à une concentration de 200 000 cellules dans 1 ml. Une fois le titre viral établi, une dose de travail de 100 TCD 50 est préparée, qui est utilisée pour identifier les virus.

6. Identification des virus dans les réactions immunitaires. L'identification ou le titrage des virus consiste à établir leur variante, leur espèce, leur genre et leur affiliation familiale. L'identification des virus s'effectue selon le principe : identifier l'inconnu du connu. Un composant bien connu dans l'identification des virus sont les sérums antiviraux spécifiques (anti-grippe, anti-rougeole, etc.), qui sont utilisés dans les réactions sérologiques de neutralisation (RN), d'inhibition de l'hémadsorption (RTGads), d'inhibition de l'hémagglutination ( HTI), RPHA, RSK, ainsi qu'en ELISA et RIA . Ces sérums contiennent des anticorps antiviraux spécifiques et sont appelés diagnostics.

Réaction de neutralisation (RN) peut être réalisée sur des cultures cellulaires, des embryons de poulet et des animaux. Les mélanges de neutralisation sont préparés dans des tubes à essai, constitués de volumes égaux de matériel contenant le virus (généralement 100 TCD50 de virus dans 1,0 ml) et de sérum de diagnostic (1,0 ml). Après agitation complète, les mélanges préparés sont laissés réagir pendant 3 heures à 37°C. Ensuite, les mélanges de neutralisation sont introduits dans une culture cellulaire sensible, qui est incubée à 37°C pendant 5 à 7 jours, après quoi les résultats du test CPP et de couleur sont pris en compte (tableau 1).

La recherche virologique comprend deux étapes principales : l'isolement des virus et leur identification. Le matériel pour la recherche virologique peut être du sang, d'autres fluides biologiques et pathologiques, des biopsies d'organes et de tissus.

Des tests sanguins virologiques sont souvent effectués pour diagnostiquer les infections à arbovirus. Les virus de la rage, des oreillons et de l'herpès simplex peuvent être trouvés dans la salive. Des prélèvements nasopharyngés sont utilisés pour isoler les agents pathogènes de la grippe et d'autres infections virales respiratoires aiguës, ainsi que de la rougeole. Les adénovirus se trouvent dans les prélèvements conjonctivals. Divers entéro-, adno-, pso-, nora- et rotavirus sont isolés des matières fécales.

Pour isoler les virus, des cultures cellulaires, des embryons de poulet et parfois des animaux de laboratoire sont utilisés.

La plupart des virus pathogènes se distinguent par la présence de tissus et par leur spécificité de type ; par exemple, le poliovirus se reproduit uniquement dans les cellules de primates, c'est pourquoi une culture tissulaire appropriée est utilisée pour isoler un virus spécifique. Pour isoler un agent pathogène inconnu, il est conseillé d'infecter simultanément 3 à 4 cultures cellulaires, en supposant que l'une d'elles puisse être sensible. La présence du virus dans les cultures cellulaires infectées est déterminée par le développement d'une dégénérescence cellulaire spécifique, c'est-à-dire action cytopathogène, détection d'inclusions intracellulaires, ainsi que basée sur la détection d'un antigène spécifique par immunofluorescence, réactions positives d'hémadsorption et d'hémagglutination.

Les embryons d'oiseaux, avec leurs tissus peu différenciés, conviennent à la culture de nombreux virus. La plupart du temps, des embryons de poulet sont utilisés. En se multipliant dans les embryons, les virus peuvent provoquer leur mort (arbovirus), l'apparition d'altérations de la membrane chorion-allantoïque (virus de la variole) ou dans le corps de l'embryon, l'accumulation de gluten dans les liquides embryonnaires (virus de la grippe, des oreillons). ) et l'antigène viral liant le complément.

L'identification des virus est réalisée à l'aide de méthodes immunologiques : réaction d'inhibition de l'hémagglutination, fixation du complément, neutralisation, précipitation sur gel, immunofluorescence.

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Les principales méthodes utilisées pour le diagnostic des maladies virales sont la culture et l’identification des virus.

Pour prouver l'étiologie virale de la maladie, il faut : isolement du virus du corps d'un poisson malade, passage de celui-ci sur une culture cellulaire ou poisson sensible, reproduction de la maladie chez des poissons sains du même ou apparenté espèces, isolement répété du même virus à partir d’animaux expérimentaux.

Pour identifier les virus, plusieurs méthodes complémentaires sont utilisées : la microscopie électronique du virus, l'étude de ses propriétés physico-chimiques, la détection de changements morphologiques caractéristiques des cellules infectées et des symptômes chez les animaux infectés, diverses méthodes immunologiques.

Les virus sont isolés principalement sur des cultures cellulaires primaires ou continues monocouches, en sélectionnant dans chaque cas des cultures sensibles à un virus donné. Pour obtenir des cultures primaires de cellules de poisson, on utilise le plus souvent les gonades de carpes femelles ou de carassins. Les gonades doivent être au stade II ou II-III de maturité selon l'échelle de Kiselevich. Ces gonades ne contiennent pas d'œufs visibles à l'œil nu. Sinon, le contenu des œufs affectera négativement la croissance cellulaire. Des cultures cellulaires de gonades de carpe et de carassin sont préparées selon une méthode approuvée.

Les lignées cellulaires suivantes sont les plus largement utilisées comme cultures continues : FHM - provenant des tissus du pédoncule caudal du vairon à tête-de-boule ; RTG - à partir de gonades de truite arc-en-ciel ; EPC - provenant de croissances de variole sur la peau de la carpe. Ces lignes sont entretenues dans des laboratoires spécialisés pour l'étude des maladies des poissons dans des instituts de recherche vétérinaire et halieutique, où elles peuvent être commandées et reçues.

Lors du diagnostic de maladies virales bien étudiées, les organes et tissus où l'agent pathogène est concentré sont examinés.

En cas de maladies des poissons, pour lesquelles les informations sont insuffisantes, les organes les plus touchés sont soumis à un examen virologique. Des grattages de peau et de branchies, des morceaux de ces organes ainsi que du mucus sont placés dans des flacons stériles contenant 2-3 ml de solution physiologique ou tampon stérile. Les échantillons d'organes internes sont prélevés dans des conditions strictement aseptiques.

Dans les cas où il est impossible d'examiner rapidement le matériel, celui-ci est conservé au maximum une journée au réfrigérateur à une température ne dépassant pas 5°C. Les matériaux congelés peuvent être stockés plus longtemps.

Le matériel pathologique destiné à la recherche est broyé dans un homogénéisateur ou broyé dans un mortier de porcelaine avec du sable de quartz. Une suspension à 10 % est préparée à partir de tissus broyés dans des solutions de Hanks, Earle, tampons ou salines et centrifugée pendant 10-15 minutes à 2000-3000 tr/min, le surnageant est aspiré avec une pipette et placé dans des flacons stériles. Si la suspension n'est pas stérile, les matériaux préparés sont filtrés sur des membranes filtrantes d'un diamètre de pores de 0,2 à 0,45 µm ou traités avec des antibiotiques (pénicilline 1 000 U/ml et streptomycine 1 000 µg/ml).

Une suspension à 20 % est préparée à partir du contenu intestinal dans de l'eau distillée stérile et centrifugée pendant 10 à 15 minutes à 2 000 tr/min. Le surnageant est à nouveau centrifugé à 4 000-5 000 tr/min pendant 30 minutes. Le surnageant est ensuite aspiré dans un flacon stérile et traité avec des antibiotiques. Ajouter 1 000 μg/ml de streptomycine et 1 000 U/ml de pénicilline pour 1 ml. Le mélange est conservé 2-3 heures à : température ambiante. Tous les matériaux sont testés pour la stérilité bactérienne par inoculation de MPB et MPA. Les matériaux préparés sont immédiatement utilisés pour le travail ou, dans les cas extrêmes, stockés congelés (à une température de moins 20°C).

Infection de culture cellulaire. Pour l'infection, des tubes avec une bonne monocouche cellulaire ou une bonne zone de croissance autour de l'explant sont utilisés. Le milieu nutritif est aspiré et 0,2 à 0,3 ml de la suspension d'essai sont ajoutés à chaque tube à essai. Dans le même temps, 0,8 à 0,9 ml de milieu nutritif contenant 2 à 3 % de sérum sont ajoutés aux tubes à essai.

Le matériel préparé à partir de chaque échantillon est utilisé pour infecter la culture tissulaire dans 4 à 6 tubes à essai. De chaque série d'études, on laisse le même nombre de tubes à essai comme contrôle, en y ajoutant 1 ml de milieu nutritif. Les tubes sont laissés à température ambiante pendant 1 à 2 heures pour que le virus soit adsorbé sur les cellules, puis le surnageant est aspiré à la pipette et le milieu nutritif d'entretien est ajouté au volume d'origine.

Les cultures cellulaires infectées et témoins sont incubées à une température de 22 à 26 °C et examinées quotidiennement sous un microscope à faible grossissement pour détecter les changements morphologiques dans les cellules. En cas de dégénérescence cellulaire sévère, le liquide de culture est aspiré et des passages sont effectués, et en l'absence d'effet cytopathogène (ECP), deux passages successifs sont effectués. Pour ce faire, un liquide de culture est utilisé conjointement avec une fraction cellulaire détruite par des congélations et décongélations répétées. Pour infecter des cultures fraîches, utilisez le surnageant de la masse cellulaire centrifugée. Le CPE après le troisième passage est pris en compte comme effet spécifique de l'agent viral.

Le degré d'endommagement de la monocouche cellulaire est évalué à l'aide du système 4-cross ; " + - dégâts jusqu'à 25%, " + + " - jusqu'à 50%, "+ + +" - jusqu'à 75% et " + + + + " - jusqu'à 100% de la monocouche.

Dans certaines maladies virales des poissons, des corps d'inclusion apparaissent dans les cellules (noyau cytoplasmique) de divers organes et tissus. Le matériel pour l'étude des inclusions virales est constitué de cultures de tissus infectés, de grattages et de frottis d'empreintes d'organes et de tissus ; avant coloration, ces matériaux sont fixés selon les méthodes généralement admises, en utilisant des liquides Dubosc-Brazil-Buena, Buena, Carnoy ou une solution à 10 % de formaldéhyde neutre.

Les inclusions virales sont colorées selon diverses méthodes : Muromtsev, Rubina, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa, etc.

Titrage des virus- détermination quantitative de l'activité virale. Le titre du virus est exprimé par le nombre d’unités infectieuses contenues par unité de volume de suspension virale. Une unité infectieuse d'un virus est définie comme la dose qui provoque l'infection de 50 % des objets sensibles infectés par celui-ci. Cette dose de virus est dite infectieuse et est désignée ID 50.

Les cultures cellulaires sont principalement utilisées comme objets sensibles lors du titrage des virus de poissons. Le titrage sur culture cellulaire est réalisé en fonction de l'effet cytopathogène des virus. Dans ce cas, ID 50 est appelée dose cytopathogène tissulaire (TCD 50) et le titre viral est exprimé par la quantité de TCD 50 dans 1 ml de suspension virale. Le titre du virus est déterminé par la méthode de dilution finale. Selon cette méthode, des cultures de cellules sensibles injectent un certain volume d'une suspension virale à des dilutions successivement croissantes et, en tenant compte du résultat de chaque injection comme positif (s'il y a un CPP) ou négatif s'il n'y a pas de CPP), le titrage le point final est calculé - 1 TCD 50.

Pour titrer les virus qui donnent un CPE prononcé, la méthode des plages est également utilisée. Dans ce cas, une monocouche de cellules infectées par le virus est versée avec un mélange de milieu nutritif avec de la gélose afin d'éviter le transfert du virus vers d'autres cellules significativement éloignées de celles initialement infectées, et de pouvoir infecter la cellule initiale. foyers d'infection de la plaque).

Chaque plaque provient d'une seule unité infectieuse, appelée PFU (plaque-forming unit), et le titre du virus est exprimé en nombre de PFU par unité de volume de suspension.

Réaction de neutralisation(IA) sur la culture cellulaire.

La réaction est basée sur la liaison de l'antigène par des anticorps d'un antisérum homologue. La réaction est utilisée pour identifier des agents pathogènes dans le diagnostic de maladies d'étiologie virale. Il vous permet de déterminer un antigène viral inconnu par des anticorps connus ou par un antigène connu (standard) - des anticorps inconnus dans les sérums de poissons malades ou guéris.

La détermination du virus isolé dans la réaction de neutralisation est effectuée à l'aide d'un ensemble d'antisérums hyperimmuns de diagnostic (anticorps) d'antigènes (virus) qui leur sont homologues.

Les antisérums hyperimmuns sont obtenus en infectant des animaux de laboratoire (par exemple des lapins) avec des souches connues de virus responsables de maladies des poissons. Les titres d'anticorps spécifiques dans les antisérums obtenus sont déterminés. Pour le travail, prenez des antisérums contenant des anticorps à titres élevés.

L'ordre de la réaction.

1. Inactivation du sérum normal et hyperimmun par chauffage à 56 o C pendant 30 minutes.

2. Préparation de dilutions d'ingrédients réactionnels. L'antigène et le sérum sont dilués avec un milieu nutritif sans sérum ni antibiotiques, à partir de 1 : 5, 1 : 50, 1 : 500 et jusqu'à obtention d'une dilution contenant moins de 1 TCD 50/0,2 ml. Le sérum hyperimmun est dilué à 1 : 2 ou 1 : 5. Si le titre est faible, le sérum est utilisé non dilué. Le sérum normal est dilué de la même manière que le sérum hyperimmun.

3. Mise en place de la réaction. Trois rangées de tubes stériles sont placées dans un portoir. Le sérum hyperimmun dilué est versé dans la première rangée, le sérum normal dilué dans la seconde et le milieu nutritif dans la troisième. Chaque ingrédient est ajouté dans un volume de 0,5 ml.

Les dilutions préparées du virus sont transférées en quantités de 0,5 ml dans les tubes à essai correspondants de chacune des trois rangées, et le virus de chaque dilution I est transféré avec une pipette séparée, en commençant par la dilution la plus élevée. Ainsi, dans chaque rangée d'éprouvettes, on obtient des dilutions successives de 10 fois du virus : 10-1, 10-2, etc.

Pour contrôler la toxicité des sérums, ajoutez 0,5 ml de la dilution préparée de sérum hyperimmun dans un tube à essai séparé, puis ajoutez une quantité égale de milieu nutritif. La même chose est faite avec du sérum normal.

Les tubes à essai contenant les mélanges sont soigneusement agités et conservés à température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, la culture cellulaire est infectée avec chaque dilution du virus (0,2 ml par tube) avec du sérum normal hyperimmun et du milieu nutritif, 4 tubes de culture cellulaire chacun. Parallèlement, des contrôles sont effectués sur la toxicité des cellules utilisées et des échantillons de culture cellulaire sont contrôlés.

Les tubes de culture cellulaire sont incubés dans un thermostat à la température optimale pour la propagation d'un virus donné, et examinés quotidiennement au microscope à faible grossissement pour détecter le CPE du virus. Les résultats sont inscrits dans le tableau (tableau 11).

Le titre du virus est exprimé par le nombre d’unités infectieuses contenues par unité de volume de suspension virale. Trouvez l'indice de neutralisation (IN). Elle correspond à la quantité maximale d'ID 50 pouvant être neutralisée par le sérum hyperimmun. IN est calculé à l'aide de la formule : logIN = logT 1 -lgT 2, où T 1 est le titre du virus en présence de sérum normal ; T 2 - titre du virus en présence de sérum hyperimmun. La valeur de IN se trouve à partir du tableau des antilogarithmes. Il est généralement admis qu'une valeur IN allant jusqu'à 10 est négative, de 10 à 49 est douteuse et 50 ou plus est un résultat positif.

Les résultats de la réaction ne peuvent être considérés comme fiables que si le sérum hyperimmun est testé pour son activité neutralisante spécifique. Pour ce faire, on détermine d'abord le titre en anticorps neutralisants dans ce sérum ou son indice de neutralisation en réaction avec un virus homologue.

Isolement des rhabdovirus par méthode sur plaque. Cette méthode est spécifique ; elle est utilisée pour l'isolement, le typage préliminaire et la sélection des rhabdovirus de la carpe et de la truite en présence d'immunsérums spécifiques pour l'identification des virus.

Des colonies rondes (plaques) se forment dans des cultures cellulaires sous une couche de gélose en présence d'un virus dans le matériel de test.

Dans des conditions aseptiques, les tissus des reins, du foie, de la rate et le liquide de la cavité abdominale sont collectés à l'aide d'une pipette Pasteur, transférés dans un flacon contenant un milieu contenant 500 UI (mcg)/ml d'antibiotiques dans un rapport de 1 : 10. Incuber pendant 60 à 90 minutes à une température de 18 à 22 °C, puis centrifuger à 2 à 3 000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant est dilué avec du milieu nutritif 1:10 (dilution 1:100). Pour infecter les cultures cellulaires, des liquides surnageants des deux dilutions sont utilisés.

Pour l'étude, une culture cellulaire continue de 3 jours cultivée dans des matelas à monocouche bien définie est sélectionnée à raison de 2 matelas pour chaque dilution de matériel pathologique et 2 matelas pour contrôle. Le milieu nutritif est retiré des flacons et 2 ml de milieu sans sérum fœtal sont ajoutés. Ensuite, 0,2 ml du matériel de test est ajouté et laissé adsorber le virus pendant 60 minutes à la température optimale pour les virus qui infectent les poissons (pour les virus de la carpe - 24-26°C et pour les virus de la truite - 16-18°C).

Le contrôle est placé dans 2 matelas de cultures cellulaires de 0,2 ml chacun, contenant 100 TCD 50/ml du virus connu, et dans 2 - 0,2 ml de milieu nutritif sans le virus.

Après 60 minutes, le liquide est retiré des flacons. Le long de la paroi opposée à la monocouche, ajouter 5 ml d'agar-agar chauffé à 40-42°C dans un flacon de 50 ml chauffé à 40-42°C (lors de l'isolement du virus VHC - pas plus de 38°C). Les matelas sont retournés en monocouche et recouverts de papier noir. Après 15 à 20 minutes, les matelas sont transférés pour incubation à la température optimale pour les virus étudiés. Les matelas sont placés avec la couche de gélose tournée vers le haut. Si le virus est inconnu, les cultures sont conservées dans deux conditions de température : 14-18 et 22-24°C.

Les cultures de cellules infectées sont visualisées sur un fond blanc. S'il y a un virus dans la culture cellulaire étudiée, des points transparents apparaissent d'abord sur le fond rose-mat de la culture. Par la suite, ils augmentent de taille, formant des colonies rondes transparentes - des plaques dont la présence indique la présence de rhabdovirus dans le matériel pathologique.

À l'aide d'une pipette Pasteur, prélever un morceau de plaque à la limite des parties affectées et non affectées afin d'inclure non seulement la couche de gélose, mais également la couche cellulaire. La pièce sélectionnée est placée dans un tube à essai avec 1 ml de milieu de croissance, congelé à moins 20°C et conservé 60 minutes. Dans le cas d'un grand nombre de plaques (toute la couche cellulaire est transparente), les études sont répétées aux dilutions de 10 -3 et 10 -4.

Des plages d'un diamètre de 3 à 8 mm de rhabdovirus de la carpe sur une culture continue d'EPC et de FHM, incubées à une température de 24 à 26°C, apparaissent au 4-7ème jour.

En l'absence de plages et en présence de CPD dans les cultures cellulaires, des études complémentaires sont réalisées sur du liquide de culture contenant le virus dans des dilutions de 10 -2 -10 -3 (2-3 passages). Les méthodes supplémentaires pour identifier les virus comprennent : la méthode des anticorps fluorescents ; détermination de la sensibilité du virus au chloroforme, à l'éther, au pH, au chauffage ; étude au microscope électronique de la morphologie des virus.

méthodes d'étude de la biologie des virus et de leur identification. En virologie, les méthodes de biologie moléculaire sont largement utilisées, à l'aide desquelles il a été possible d'établir la structure moléculaire des particules virales, les méthodes de leur pénétration dans la cellule et les caractéristiques de la reproduction virale, la structure primaire des acides nucléiques et des protéines viraux. Des méthodes sont en cours de développement pour déterminer la séquence des éléments constitutifs des acides nucléiques viraux et des acides aminés protéiques. Il devient possible de lier les fonctions des acides nucléiques et des protéines qu'ils codent avec la séquence nucléotidique et d'établir les causes des processus intracellulaires qui jouent un rôle important dans la pathogenèse de l'infection virale.

Les méthodes de recherche virologique reposent également sur des processus immunologiques (interaction de l'antigène avec des anticorps), des propriétés biologiques du virus (capacité d'hémagglutination, hémolyse, activité enzymatique), des caractéristiques de l'interaction du virus avec la cellule hôte (caractéristique de l'effet cytopathique , formation d'inclusions intracellulaires, etc.).

Dans le diagnostic des infections virales, dans la culture, l'isolement et l'identification des virus, ainsi que dans la production de préparations vaccinales, la méthode de culture tissulaire et cellulaire est largement utilisée. Des cultures cellulaires primaires, secondaires, stables, continues et diploïdes sont utilisées. Les cultures primaires sont obtenues en dispersant les tissus avec des enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase). La source de cellules peut être des tissus et des organes (généralement des reins) d'embryons humains et animaux. Une suspension de cellules dans un milieu nutritif est placée dans ce qu'on appelle des matelas, des bouteilles ou des boîtes de Pétri, où, après s'être fixées à la surface du récipient, les cellules commencent à se multiplier. Pour l'infection virale, une monocouche cellulaire est généralement utilisée. Le liquide nutritif est drainé, la suspension virale est ajoutée dans certaines dilutions et après contact avec les cellules, un milieu nutritif frais, généralement sans sérum, est ajouté.

Les cellules de la plupart des cultures primaires peuvent être repiquées ; une telle culture est appelée culture secondaire. Avec le passage ultérieur des cellules, une population de cellules de type fibroblaste se forme, capables de se reproduire rapidement, dont la plupart conservent l'ensemble original de chromosomes. Ce sont des cellules dites diploïdes. En cultivant des cellules en série, des cultures cellulaires continues et stables sont obtenues. Au cours des passages, des cellules homogènes à division rapide avec un ensemble hétéroploïde de chromosomes apparaissent. Les lignées cellulaires stables peuvent être monocouches ou en suspension. Les cultures monocouches se développent sous la forme d'une couche continue sur la surface du verre, tandis que les cultures en suspension se développent sous la forme de suspensions dans divers récipients utilisant des dispositifs de mélange. Il existe plus de 400 lignées cellulaires dérivées de 40 espèces animales différentes (dont les primates, les oiseaux, les reptiles, les amphibiens, les poissons, les insectes) et les humains.

Des morceaux d’organes et de tissus individuels (cultures d’organes) peuvent être cultivés dans des milieux nutritifs artificiels. Ces types de cultures préservent la structure tissulaire, ce qui est particulièrement important pour l’isolement et le passage des virus qui ne se reproduisent pas dans des cultures de tissus indifférenciés (par exemple les coronavirus).

Dans les cultures cellulaires infectées, les virus peuvent être détectés par des modifications de la morphologie cellulaire, des effets cytopathiques qui peuvent être spécifiques, l'apparition d'inclusions, par le dosage des antigènes viraux dans la cellule et dans le liquide de culture ; établir les propriétés biologiques de la descendance virale dans un liquide de culture et titrer les virus dans des cultures tissulaires, des embryons de poulet ou des animaux sensibles ; en identifiant des acides nucléiques viraux individuels dans des cellules par hybridation moléculaire ou accumulations d'acides nucléiques par la méthode cytochimique utilisant la microscopie à fluorescence.

L’isolement des virus est un processus long et laborieux. Elle est réalisée pour déterminer le type ou le variant du virus circulant dans la population (par exemple, pour identifier un sérovariant du virus de la grippe, une souche sauvage ou vaccinale du virus de la polio, etc.) ; dans les cas où il est nécessaire de prendre des mesures épidémiologiques urgentes ; lorsque de nouveaux types ou variantes de virus apparaissent ; si nécessaire, confirmer le diagnostic préliminaire ; pour l'indication de virus dans les objets environnementaux. Lors de l'isolement des virus, la possibilité de leur persistance dans le corps humain, ainsi que l'apparition d'une infection mixte causée par deux ou plusieurs virus, est prise en compte. Une population génétiquement homogène du virus obtenue à partir d'un virion est appelée clone viral, et le processus d'obtention est appelé clonage.

Pour isoler les virus, on utilise l'infection d'animaux de laboratoire sensibles et d'embryons de poulet, mais le plus souvent, la culture tissulaire est utilisée. La présence d'un virus est généralement déterminée par une dégénérescence cellulaire spécifique (effet cytopathique), la formation de symplastes et de syncytia, la détection d'inclusions intracellulaires, ainsi qu'un antigène spécifique détecté par immunofluorescence, hémadsorption, hémagglutination (pour les virus hémagglutinants), etc. . Ces signes ne peuvent être détectés qu’après 2-3 passages du virus.

Pour isoler un certain nombre de virus, tels que les virus de la grippe, des embryons de poulet sont utilisés, et pour isoler certains virus Coxsackie et un certain nombre d'arbovirus, des souris nouveau-nées sont utilisées. L'identification des virus isolés est réalisée à l'aide de réactions sérologiques et d'autres méthodes.

Lorsque vous travaillez avec des virus, leur titre est déterminé. Le titrage des virus est généralement effectué dans une culture tissulaire, déterminant la dilution la plus élevée du liquide contenant le virus à laquelle se produit la dégénérescence tissulaire, les inclusions et les antigènes spécifiques du virus se forment. La méthode des plages peut être utilisée pour titrer un certain nombre de virus. Les plaques, ou colonies négatives de virus, sont des foyers de cellules détruites par le virus dans une culture tissulaire monocouche sous une couche de gélose. Le comptage des colonies permet une analyse quantitative de l’activité infectieuse des virus en partant du principe qu’une particule virale infectieuse forme une plaque. Les plaques sont détectées en colorant la culture avec des colorants intravitales, généralement du rouge neutre ; les plaques n'adsorbent pas le colorant et sont donc visibles sous forme de taches lumineuses sur le fond des cellules vivantes colorées. Le titre du virus est exprimé en nombre d'unités formant des plages pour 1 ml.

La purification et la concentration des virus sont généralement réalisées par ultracentrifugation différentielle suivie d'une centrifugation par concentration ou par gradient de densité. Pour purifier les virus, des méthodes immunologiques, la chromatographie par échange d'ions, des immunosorbants, etc. sont utilisés.

Le diagnostic en laboratoire des infections virales comprend la détection de l'agent pathogène ou de ses composants dans le matériel clinique ; isoler le virus de ce matériel ; sérodiagnostic. Le choix de la méthode de diagnostic en laboratoire dans chaque cas individuel dépend de la nature de la maladie, de la durée de la maladie et des capacités du laboratoire. Le diagnostic moderne des infections virales repose sur des méthodes expresses qui permettent d'obtenir une réponse plusieurs heures après le prélèvement de matériel clinique dans les premiers stades de la maladie, notamment la microscopie électronique et immunitaire électronique, ainsi que l'immunofluorescence, la méthode d'hybridation moléculaire. , détection d'anticorps de la classe IgM, etc.

La microscopie électronique des virus colorés négativement permet de différencier les virus et de déterminer leur concentration. L'utilisation de la microscopie électronique dans le diagnostic des infections virales est limitée aux cas où la concentration de particules virales dans le matériel clinique est assez élevée (10 5 sur 1). ml et plus haut). L’inconvénient de cette méthode est l’incapacité de distinguer les virus appartenant au même groupe taxonomique. Cette déficience est surmontée grâce à l’utilisation de la microscopie électronique immunitaire. La méthode repose sur la formation de complexes immuns en ajoutant du sérum spécifique aux particules virales, tout en concentrant simultanément les particules virales, permettant leur identification. La méthode est également utilisée pour détecter des anticorps. À des fins de diagnostic express, un examen au microscope électronique des extraits de tissus, des matières fécales, du liquide des vésicules et des sécrétions du nasopharynx est effectué. La microscopie électronique est largement utilisée pour étudier la morphogenèse du virus ; ses capacités sont élargies avec l'utilisation d'anticorps marqués.

La méthode d'hybridation moléculaire, basée sur la détection d'acides nucléiques spécifiques du virus, permet de détecter des copies uniques de gènes et n'a pas d'égale en sensibilité. La réaction repose sur l’hybridation de brins d’ADN ou d’ARN complémentaires (sondes) et la formation de structures double brin. La sonde la moins chère est l’ADN recombinant cloné. La sonde est marquée avec des précurseurs radioactifs (généralement du phosphore radioactif). L'utilisation de réactions colorimétriques est prometteuse. Il existe plusieurs options d'hybridation moléculaire : hybridation ponctuelle, hybridation par blot, hybridation sandwich, hybridation in situ, etc.

Les anticorps de la classe IgM apparaissent plus tôt que les anticorps de la classe G (du 3ème au 5ème jour de la maladie) et disparaissent au bout de quelques semaines, leur détection indique donc une infection récente. Les anticorps de la classe lgM sont détectés par immunofluorescence ou par dosage immunoenzymatique utilisant des antisérums anti-μ (sérums contre les chaînes lourdes de l'IgM).

Les méthodes sérologiques en virologie sont basées sur des réactions immunologiques classiques (voir Méthodes de recherche immunologique) : réactions de fixation du complément, inhibition de l'hémagglutination, neutralisation biologique, immunodiffusion, hémagglutination indirecte, hémolyse radiale, immunofluorescence, dosage immunoenzymatique, dosage radioimmunologique. Des microméthodes pour de nombreuses réactions ont été développées et leurs techniques sont constamment améliorées. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les virus à l'aide d'un ensemble de sérums connus et pour le sérodiagnostic afin de déterminer l'augmentation des anticorps dans le deuxième sérum par rapport au premier (le premier sérum est prélevé dans les premiers jours après la maladie, le second - après 2- 3 semaines). Une valeur diagnostique n'est pas inférieure à une multiplication par quatre des anticorps dans le deuxième sérum. Si la détection d'anticorps de la classe IgM indique une infection récente, alors les anticorps de la classe IgC persistent plusieurs années, et parfois toute la vie.

Pour identifier les antigènes individuels des virus et leurs anticorps dans des mélanges complexes sans purification préalable des protéines, l'immunotransfert est utilisé. La méthode combine le fractionnement des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec une immuno-indication ultérieure des protéines à l'aide de la méthode de dosage immunoenzymatique. La séparation des protéines réduit les exigences de pureté chimique de l'antigène et permet d'identifier des paires antigène-anticorps individuelles. Cette tâche est pertinente, par exemple, dans le sérodiagnostic de l'infection par le VIH, où les réactions faussement positives du test immuno-enzymatique sont causées par la présence d'anticorps contre les antigènes cellulaires, qui sont présents en raison d'une purification insuffisante des protéines virales. L'identification des anticorps dans les sérums des patients contre les antigènes viraux internes et externes permet de déterminer le stade de la maladie, et lors de l'analyse des populations, la variabilité des protéines virales. L'immunotransfert pour l'infection par le VIH est utilisé comme test de confirmation pour identifier les antigènes viraux individuels et les anticorps dirigés contre eux. Lors de l’analyse des populations, la méthode est utilisée pour déterminer la variabilité des protéines virales. Le grand intérêt de la méthode réside dans la possibilité d'analyser les antigènes synthétisés à l'aide de la technologie de l'ADN recombinant, en établissant leurs tailles et la présence de déterminants antigéniques.

20) Le principal composant structurel des virions (particules virales complètes) est une nucléocapside, c'est-à-dire le boîtier protéique (capside) qui contient le génome viral (ADN ou ARN). La nucléocapside de la plupart des familles virales est entourée d’une enveloppe lipoprotéique. Entre l'enveloppe et la nucléocapside de certains virus (ortho-, paramyxo-, rhabdo-, phylo- et rétrovirus) se trouve une protéine matricielle non glycosylée qui donne une rigidité supplémentaire aux virions. Les virus de la plupart des familles possèdent une enveloppe qui joue un rôle important dans l’infectiosité. Les virions acquièrent leur enveloppe externe lorsque la nucléocapside pénètre dans la membrane cellulaire par bourgeonnement. Les protéines de l'enveloppe sont codées par le virus et les lipides sont extraits de la membrane cellulaire. Les glycoprotéines, généralement sous forme de dimères et de trimères, forment des péplomères (saillies) à la surface des virions (ortho-, paramyxovirus, rhabdo-, phylo-, corona-, bunya-, arena-, rétrovirus). Les protéines de fusion glycosylées sont associées aux péplomères et jouent un rôle clé dans l'entrée du virus dans la cellule. Les capsides et enveloppes des virions sont formées par plusieurs copies d’un ou plusieurs types de sous-unités protéiques grâce à un processus d’auto-assemblage. L'interaction dans le système protéine-protéine, due à la faiblesse des liaisons chimiques, conduit à l'association de capsides symétriques. Les différences entre les virus dans la forme et la taille des virions dépendent de la forme, de la taille et du nombre de sous-unités protéiques structurelles et de la nature de l'interaction entre elles. La capside est constituée de nombreuses sous-unités morphologiquement distinctes (capsomères), assemblées à partir de polypeptides viraux de manière strictement définie, conformément à des principes géométriques relativement simples. Les sous-unités protéiques, reliées les unes aux autres, forment des capsides de deux types de symétrie : isométrique et hélicoïdale. La structure de la nucléocapside des virus enveloppés est similaire à la structure de la nucléocapside des virus non enveloppés. À la surface de la coque du virus, on distingue des structures glycoprotéiques exprimées morphologiquement - les péplomères. La composition de la coque de la supercapside comprend des lipides (jusqu'à 20 à 35 %) et des glucides (jusqu'à 7 à 8 %) d'origine cellulaire. Il se compose d’une double couche de lipides cellulaires et de protéines spécifiques du virus situées à l’extérieur et à l’intérieur de la biocouche lipidique. La couche externe de la coque de la supercapside est représentée par des péplomères (saillies) d'un ou plusieurs types, constitués d'une ou plusieurs molécules de glycoprotéine. La nucléocapside des virus enveloppés est souvent appelée le noyau, et la partie centrale des virions contenant l'acide nucléique est appelée le nucléoïde. Les capsomères (péplomères) sont constitués d'unités structurelles construites à partir d'une ou plusieurs chaînes polypeptidiques homologues ou hétérologues (sous-unités protéiques). classification des virus Les capsides isométriques ne sont pas des sphères, mais des polyèdres réguliers (icosaèdres). Leurs dimensions linéaires sont identiques le long des axes de symétrie. Selon Kaspar et Klug (1962), les capsomères des capsides sont disposés selon une symétrie icosaédrique. Ces capsides sont constituées de sous-unités identiques qui forment un icosaèdre. Ils ont 12 sommets (coins), 30 faces et 20 surfaces en forme de triangles isocèles. Conformément à cette règle, la capside du poliovirus et du virus de la fièvre aphteuse est formée de 60 unités structurelles protéiques, chacune constituée de quatre chaînes polypeptidiques. L'icosaèdre résout de manière optimale le problème du regroupement de sous-unités répétitives dans une structure compacte stricte avec un volume minimum. Seules certaines configurations de sous-unités structurelles peuvent former des surfaces et former des sommets et des faces de l'icosaèdre viral. Par exemple, les sous-unités structurelles de l’adénovirus forment des capsomères hexagonaux (hexons) sur les surfaces et les bords, et des capsomères pentaédriques (peptones) sur les sommets. Dans certains virus, les deux types de capsomères sont formés par les mêmes polypeptides, dans d'autres, par des polypeptides différents. Étant donné que les sous-unités structurelles des différents virus diffèrent les unes des autres, certains virus semblent plus hexagonaux, d’autres plus sphériques. Tous les virus vertébrés contenant de l'ADN connus, à l'exception des virus de la variole, ainsi que de nombreux virus contenant de l'ARN (7 familles), ont une symétrie de capside de type cubique. Les réovirus, contrairement aux autres virus vertébrés, possèdent une double capside (externe et interne), chacune constituée d'unités morphologiques. Les virus présentant une symétrie de type hélicoïdal ont l'apparence d'une structure cylindrique filiforme ; leur ARN génomique a la forme d'une hélice et est situé à l'intérieur de la capside. Tous les virus animaux à symétrie hélicoïdale sont entourés d'une enveloppe lipoprotéique. Les nucléocapsides hélicoïdales sont caractérisées par la longueur, le diamètre, le pas d'hélice et le nombre de capsomères par tour d'hélice. Ainsi, chez le virus Sendai (paramyxovirus), la nucléocapside est une hélice d'environ 1 µm de long, 20 nm de diamètre et 5 nm de pas. La capside est constituée d'environ 2 400 unités structurelles, chacune étant une protéine d'un poids moléculaire de 60 kDa. Il y a 11 à 13 sous-unités pour chaque tour d'hélice. Dans les virus présentant une symétrie de nucléocapside de type hélicoïdal, le repliement des molécules protéiques en hélice garantit une interaction maximale entre l'acide nucléique et les sous-unités protéiques. Dans les virus icosaédriques, l'acide nucléique est enroulé à l'intérieur des virions et interagit avec un ou plusieurs polypeptides situés à l'intérieur de la capside.

Antirécepteurs (récepteurs) viraux- des protéines du virion de surface, par exemple l'hémagglutinine, qui se lient de manière complémentaire au récepteur correspondant de la cellule sensible.

21) Méthodes immunologiques dans les études virologiques.

Les tests sérologiques varient dans leur capacité à détecter des classes individuelles d'anticorps. Le test d’agglutination, par exemple, détecte bien les anticorps IgG, mais est moins sensible pour détecter les anticorps IgG. Les réactions de fixation du complément et d'hémolyse, qui nécessitent du complément, ne sont pas détectées par les anticorps non fixateurs du complément, tels que les anticorps IgA et les anticorps IgE. La réaction de neutralisation du virus fait intervenir uniquement des anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques de la surface du virion associés au pouvoir pathogène. Sensibilité I. m. et. surpasse toutes les autres méthodes d'étude des antigènes et des anticorps ; en particulier, les dosages radioimmunologiques et immunoenzymatiques permettent de détecter la présence de protéines dans des quantités mesurées en nanogrammes et même en picogrammes. Avec l'aide de I. m. et. déterminer le groupe et vérifier la sécurité du sang (hépatite B et infection par le VIH). Lors de la transplantation de tissus et d'organes, je. m. et. vous permettent de déterminer la compatibilité des tissus et les méthodes de test pour supprimer l'incompatibilité. En médecine légale, la réaction de Castellani est utilisée pour déterminer la spécificité d'espèce d'une protéine et la réaction d'agglutination pour déterminer le groupe sanguin.

Les méthodes immunologiques sont largement utilisées dans le diagnostic en laboratoire des maladies infectieuses. L'étiologie de la maladie est également établie sur la base de l'augmentation des anticorps contre l'agent pathogène dans le sérum sanguin de convalescence par rapport à un échantillon prélevé dans les premiers jours de la maladie. Basé sur I. m. et. étudier l'immunité de la population contre les infections de masse, comme la grippe, et évaluer également l'efficacité des vaccinations préventives.

En fonction de leur mécanisme et en tenant compte des résultats de I. m. et. peut être divisé en réactions basées sur le phénomène d'agglutination ; des réactions basées sur le phénomène de précipitation ; réactions impliquant le complément ; réaction de neutralisation; réactions utilisant des méthodes chimiques et physiques.

Réactions basées sur le phénomène d'agglutination. L'agglutination est le collage de cellules ou de particules individuelles portant un antigène à l'aide d'un sérum immunitaire sur cet antigène.

La réaction d'agglutination bactérienne utilisant le sérum antibactérien approprié est l'une des réactions sérologiques les plus simples. Une suspension de bactéries est ajoutée à différentes dilutions du sérum sanguin à tester et après un certain temps de contact à t°37°, on enregistre à quelle dilution la plus élevée de l'agglutination du sérum sanguin se produit. La réaction d'agglutination bactérienne est utilisée pour diagnostiquer de nombreuses maladies infectieuses : brucellose, tularémie, fièvre typhoïde et paratyphoïde, dysenterie bacillaire, typhus.

Réaction d'hémagglutination passive ou indirecte (RPHA, RNHA). Il utilise des globules rouges ou des matériaux synthétiques neutres (par exemple des particules de latex), à la surface desquels sont sorbés des antigènes (bactériens, viraux, tissulaires) ou des anticorps. Leur agglutination se produit lorsque des sérums ou des antigènes appropriés sont ajoutés.

La réaction d'hémagglutination passive est utilisée pour diagnostiquer les maladies causées par des bactéries (fièvre typhoïde et paratyphoïde, dysenterie, brucellose, peste, choléra, etc.), des protozoaires (paludisme) et des virus (grippe, infections adénovirales, hépatite virale B, rougeole, tiques). encéphalite transmise, fièvre hémorragique de Crimée, etc.), ainsi que pour déterminer certaines hormones, pour identifier l'hypersensibilité du patient aux médicaments et aux hormones, comme la pénicilline et l'insuline.

La réaction d'inhibition de l'hémagglutination (HAI) est basée sur le phénomène du sérum immunitaire empêchant (inhibant) l'hémagglutination des érythrocytes par les virus et est utilisée pour détecter et titrer les anticorps antiviraux. Il constitue la principale méthode de sérodiagnostic de la grippe, de la rougeole, de la rubéole, des oreillons, de l'encéphalite à tiques et d'autres infections virales dont les agents responsables ont des propriétés hémagglutinantes. par exemple, pour le sérodiagnostic de l’encéphalite à tiques, des dilutions au double du sérum du patient dans une solution tampon alcaline au borate sont versées dans les puits du panel. Puis on ajoute une certaine quantité, généralement 8 UA (unités agglutinantes), d'antigène de l'encéphalite à tiques et après 18 heures d'exposition à t°4°, on ajoute une suspension d'hématies d'oie préparées dans une solution acide tamponnée au phosphate. . Si le sérum sanguin du patient contient des anticorps contre le virus de l’encéphalite à tiques, l’antigène est neutralisé et l’agglutination des globules rouges ne se produit pas.

Réactions basées sur le phénomène de précipitation. La précipitation résulte de l'interaction d'anticorps avec des antigènes solubles. L'exemple le plus simple d'une réaction de précipitation est la formation dans un tube à essai d'une bande de précipitation opaque à la limite de la stratification de l'antigène sur l'anticorps. Différents types de réactions de précipitation en gels d'agar semi-liquide ou d'agarose sont largement utilisés (méthode de double immunodiffusion selon Ouchterlohn, méthode d'immunodiffusion radiale, immunoélectrophorèse), qui sont à la fois qualitatives et quantitatives. En raison de la libre diffusion des antigènes et des anticorps dans le gel dans la zone de leur rapport optimal, des complexes spécifiques se forment - des bandes de précipitation, qui sont détectées visuellement ou par coloration. Une particularité de la méthode est que chaque paire antigène-anticorps forme une bande de précipitation individuelle et que la réaction ne dépend pas de la présence d'autres antigènes et anticorps dans le système étudié.

Les réactions impliquant le complément, qui est du sérum sanguin frais de cobaye, sont basées sur la capacité du sous-composant du complément Clq, puis d'autres composants du complément, à se fixer aux complexes immuns.

La réaction de fixation du complément (CFR) permet le titrage d'antigènes ou d'anticorps selon le degré de fixation du complément par le complexe antigène-anticorps. Cette réaction se compose de deux phases : l'interaction de l'antigène avec le sérum sanguin à tester (système de test) et l'interaction du sérum hémolytique avec les globules rouges de mouton (système indicateur). Avec une réaction positive dans le système étudié, une fixation du complément se produit, puis avec l'ajout d'érythrocytes sensibilisés par des anticorps, aucune hémolyse n'est observée. La réaction est utilisée pour le sérodiagnostic de la syphilis (réaction de Wassermann), des infections virales et bactériennes.

La réaction de neutralisation repose sur la capacité des anticorps à neutraliser certaines fonctions spécifiques des antigènes macromoléculaires ou solubles, par exemple l'activité enzymatique, les toxines bactériennes et la pathogénicité virale. La réaction de neutralisation des toxines peut être évaluée par l'effet biologique, par exemple, les sérums antitétaniques et antibotuliques sont titrés. Un mélange de toxine et d'antisérum administré aux animaux ne provoque pas leur mort. Différentes versions de la réaction de neutralisation sont utilisées en virologie. En mélangeant les virus avec l'antisérum approprié et en introduisant ce mélange chez les animaux ou dans les cultures cellulaires, le pouvoir pathogène des virus est neutralisé et les animaux ne tombent pas malades, et les cellules des cultures ne sont pas détruites.

Réactions utilisant des marqueurs chimiques et physiques. L'immunofluorescence implique l'utilisation d'anticorps marqués aux fluorochromes, plus précisément de la fraction immunoglobuline des anticorps IgG. Un anticorps marqué avec un fluorochrome forme un complexe antigène-anticorps avec un antigène, qui devient accessible à l'observation au microscope dans les rayons UV qui excitent le fluorochrome. La réaction d'immunofluorescence directe est utilisée pour étudier les antigènes cellulaires, détecter les virus dans les cellules infectées et détecter les bactéries et les rickettsies dans les frottis.

La méthode d'immunofluorescence indirecte est plus largement utilisée. basé sur la détection du complexe antigène-anticorps à l'aide d'un sérum immun luminescent contre les anticorps IgG et utilisé pour détecter non seulement les antigènes, mais également titrer les anticorps.

Les méthodes immunoenzymatiques, ou enzymatiques-immunologiques, reposent sur l'utilisation d'anticorps conjugués à des enzymes, principalement la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline. Semblable à l’immunofluorescence, la méthode de dosage immunoenzymatique est utilisée pour détecter les antigènes dans les cellules ou titrer les anticorps sur les cellules contenant l’antigène.

La méthode radioimmunologique repose sur l’utilisation de marqueurs radio-isotopiques d’antigènes ou d’anticorps. C'est la méthode la plus sensible pour déterminer les antigènes et les anticorps ; elle est utilisée pour déterminer les hormones, les médicaments et les antibiotiques, pour diagnostiquer les maladies bactériennes, virales, rickettsiennes, protozoaires, pour étudier les protéines sanguines et les antigènes tissulaires.

L’immunotransfert est utilisé pour détecter les anticorps dirigés contre des antigènes individuels ou pour « reconnaître » les antigènes à partir de sérums connus. La méthode comprend 3 étapes : séparation de macromolécules biologiques (par exemple, un virus) en protéines individuelles par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ; transférer les protéines séparées du gel sur un support solide (blot) en plaçant une plaque de gel de polyacrylamide sur du papier activé ou de la nitrocellulose (électroblot) ; détection des protéines souhaitées sur le substrat par dosage immunoenzymatique direct ou indirect. L'immunotransfert est utilisé comme méthode de diagnostic de l'infection par le VIH. La détection d'anticorps dirigés contre l'une des protéines de l'enveloppe externe du virus a une valeur diagnostique.

22) Types de symétrie des virus (cubique, spirale, mixte). Interaction des protéines et des acides nucléiques lors de l'empaquetage des génomes viraux.

En fonction de l'interaction de la capside avec l'acide nucléique, les particules virales peuvent être divisées en plusieurs types de symétrie :

1). Type cubique de symétrie.

Les capsides cubiques sont des icosiders avec environ 20 surfaces triangulaires et 12 sommets. Ils forment une structure ressemblant à une formation sphérique, mais il s'agit en fait d'un polyèdre. Dans certains cas, des formations lipoprotéiques spéciales appelées épines sont attachées aux sommets de ces polyèdres icosaédriques. Le rôle de ces pointes est vraisemblablement réduit à l’interaction de virions ou de particules virales avec les zones correspondantes des cellules hôtes qui y sont sensibles. Avec une symétrie cubique, l'acide nucléique viral est étroitement emballé (enroulé en boule) et des molécules de protéines l'entourent, formant un polyèdre (icosaèdre). Un icosaèdre est un polyèdre à vingt faces triangulaires, de symétrie cubique et de forme approximativement sphérique. Les virus icosaédriques comprennent le virus de l'herpès simplex, les réovirus, etc.

2). Type de symétrie en spirale. Les capsides hélicoïdales ont une structure un peu plus simple. Ceux. Les capsomères qui composent la capside recouvrent la NA hélicoïdale et forment également une coque protéique assez stable de ces virus. Et en utilisant des microscopes électroniques à haute résolution et des méthodes de préparation appropriées, on peut voir des structures hélicoïdales sur les virus. Avec la symétrie hélicoïdale de la capside, l'acide nucléique viral forme une figure en spirale (ou hélicoïdale), creuse à l'intérieur, et les sous-unités protéiques (capsomères) sont également disposées autour de lui en spirale (capside tubulaire). Un exemple de virus présentant une symétrie de capside hélicoïdale est le virus de la mosaïque du tabac, qui est en forme de bâtonnet et mesure 300 nm de long et 15 nm de diamètre. La particule virale contient une molécule d’ARN d’environ 6 000 nucléotides. La capside est constituée de 2000 sous-unités protéiques identiques disposées en spirale.

3). Type de symétrie mixte ou complexe. En règle générale, ce type de symétrie est détecté principalement parmi les virus bactériens. Et les exemples classiques sont ces phages, E. coli ou phages tempérés. Ce sont des formations complexes qui ont une tête avec un contenu nucléique interne, divers types d'appendices, un processus de queue et des dispositifs plus ou moins complexes. Et chaque composant de ces particules est doté d'une fonction spécifique qui est réalisée lors de l'interaction du virus avec la cellule. En d’autres termes, un type complexe de symétrie est une combinaison de symétrie cubique, la tête est un polyèdre icosider et les formations en forme de bâtonnet sont les processus de queue. Mais parmi les virus bactériens, il existe aussi des virions tout simplement organisés qui sont des nucléocapsides primitives, de forme sphérique ou cubique. Les virus bactériens sont les plus complexes par rapport aux virus végétaux et aux virus animaux.

24) Interaction du phage avec la cellule. Phages virulents et tempérés.

Adsorption.

L'interaction commence par la fixation de particules virales à la surface cellulaire. Le processus devient possible en présence de récepteurs appropriés à la surface de la cellule et d’antirécepteurs à la surface de la particule virale.

Les virus utilisent des récepteurs cellulaires conçus pour transporter les substances nécessaires : particules nutritionnelles, hormones, facteurs de croissance, etc.

Récepteurs : protéines, composant glucidique des protéines et lipides, lipides. Des récepteurs spécifiques déterminent le sort ultérieur de la particule virale (transport, délivrance vers des zones du cytoplasme ou du noyau). Le virus peut également s’attacher à des récepteurs non spécifiques et même pénétrer dans la cellule. Cependant, ce processus ne provoque pas le développement d’une infection.

Tout d’abord, une simple liaison entre l’antirécepteur et le récepteur est formée. Une telle connexion est fragile et peut être rompue. Pour la formation d’une adsorption irréversible, une fixation multivalente est nécessaire. Une liaison stable se produit en raison du libre mouvement des molécules réceptrices dans la membrane. Lorsqu'un virus interagit avec une cellule, on observe une augmentation de la fluidité lipidique et la formation de champs récepteurs dans la zone d'interaction entre le virus et la cellule. Les récepteurs de certains virus ne peuvent être présents que dans un ensemble limité de cellules hôtes. Cela détermine la sensibilité du corps à ce virus. Ainsi, l’ADN et l’ARN viraux ont la capacité d’infecter un plus large éventail de cellules hôtes.

Les antirécepteurs peuvent être trouvés dans des organites viraux uniques : structures d’appendices dans les bactériophages T, fibres dans les adénovirus, pointes à la surface des membranes virales, couronne dans les coronavirus.

Pénétration.

2 mécanismes – endocytose des récepteurs et fusion membranaire.

Endocytose des récepteurs :

Le mécanisme habituel d'entrée des nutriments et des substances régulatrices dans la cellule. Se produit dans des zones spécialisées - où se trouvent des fosses spéciales recouvertes de clathrine ; au fond de la fosse se trouvent des récepteurs spécifiques. Les puits permettent une invagination rapide et la formation de vacuoles recouvertes de clathrine (pas plus de 10 minutes ne s'écoulent à partir du moment de l'adsorption ; jusqu'à 2 000 vacuoles peuvent se former en une minute). Les vacuoles fusionnent avec des vacuoles cytoplasmiques plus grandes, formant des récepteurs (ne contenant plus de clathrine), qui à leur tour fusionnent avec les lysosomes.

Fusion des membranes virales et cellulaires :

Dans les virus enveloppés, la fusion est provoquée par des interactions ponctuelles de la protéine virale avec les lipides de la membrane cellulaire, à la suite de quoi l'enveloppe lipoprotéique virale s'intègre à la membrane cellulaire. Dans les virus non enveloppés, l'une des protéines de surface interagit également avec les lipides des membranes cellulaires et le composant interne traverse la membrane (chez les paramyxovirus c'est la protéine F, chez les orthomyxovirus c'est la sous-unité hémagglutinante HA2). La conformation des protéines de surface est influencée par le pH.

Bande.

Au cours de ce processus, l'activité infectieuse disparaît, une sensibilité aux nucléases apparaît souvent et une résistance aux anticorps apparaît. Le produit final du déshabillage est constitué d’acides nucléiques liés à la protéine virale interne. L’étape de déshabillage limite également les risques d’infection (les virus ne sont pas capables de se déshabiller dans chaque cellule). Le déshabillage s'effectue dans des zones spécialisées de la cellule : lysosomes, appareil de Golgi, espace périnucléaire.

Le déshabillage résulte d'un certain nombre de réactions. Par exemple, chez les picornavirus, le déshabillage se produit avec la formation de particules sous-virales intermédiaires de tailles allant de 156 à 12S. Chez les adénovirus dans le cytoplasme et les pores nucléaires, il comporte au moins 3 stades :

Formation de particules sous-virales de densité supérieure à celle des virions ;

Formation de noyaux dépourvus de 3 protéines virales ;

Formation d'un complexe ADN-protéine dans lequel l'ADN est lié de manière covalet à une protéine terminale.

Caractéristiques des phages virulents et tempérés.

Lorsqu'une bactérie est infectée par un phage, il se produit une infection dite lytique, c'est-à-dire une infection qui se termine par la lyse de la cellule hôte, mais cela n'est caractéristique que des phages dits virulents, dont l'interaction avec le La cellule conduit à la mort cellulaire et à la formation de descendants de phages.

Dans ce cas, on distingue les étapes suivantes selon les interactions du phage avec la cellule : mélange du phage avec la culture cellulaire (la multiplicité d'infection est de 1 phage pour 10 cellules), et la concentration doit être suffisamment élevée pour permettre aux phages pour contacter les cellules. Pour éviter une réinfection - après une infection pendant 5 minutes maximum, lorsque les phages sont adsorbés - ce mélange de cellules avec le phage est dilué. Il y a une période de latence pendant laquelle le nombre de phages n'augmente pas, puis une très courte période de libération, lorsque le nombre de particules de phages augmente fortement, lorsque la cellule est lysée et que la descendance du phage est libérée, puis le nombre de phages reste au même niveau, car la réinfection ne se produit pas. Sur la base de cette courbe, nous pouvons distinguer ces phases : la période végétative de « croissance » (période de latence), la période de libération, et calculer le rendement en phages pour 1 cellule infectée. Pendant la période de latence, il n'est pas possible de détecter quoi que ce soit de semblable aux particules de phage dans les bactéries et il n'est pas possible d'isoler le principe infectieux de ces cellules pendant la période de latence. Seules les particules de phages matures sont capables de provoquer une infection bactérienne. Ainsi, les phages virulents provoquent toujours la mort des bactéries et produisent une infection, qui se manifeste par la production de nouvelles particules virales capables d'infecter les cellules suivantes et d'autres qui y sont sensibles.

Contrairement aux virulentes, l'infection par les phages tempérés ne conduit pas à la lyse des cellules bactériennes, mais la formation d'un état particulier de coexistence du phage avec la cellule bactérienne est réalisée. Cette coexistence s'exprime dans le fait qu'un certain début de phage est présent dans la cellule bactérienne sans conditions défavorables et est préservé de génération en génération. À certaines étapes d'une telle coexistence, le phage est activé dans la cellule et entre dans un état de cycle de développement lytique, provoquant la lyse cellulaire et la libération de la descendance du phage. Ces phages sont appelés phages lysogènes ou tempérés, et l'état d'existence modérée avec le phage est la lysogénie, et les bactéries qui contiennent un tel phage caché sont des bactéries lysogènes. Le terme bactérie lysogène vient du fait qu'on a découvert autrefois des cultures dans lesquelles un phage apparaissait spontanément, et ce bactériophage a commencé à être considéré comme une contamination de la culture, c'est-à-dire qu'un virus bactérien pénètre dans la culture, et de telles cultures étaient appelées lysogènes. c'est-à-dire qu'ils génèrent une lyse .

Le diagnostic d'ACI est établi sur la base de données cliniques et épidémiologiques, avec confirmation obligatoire en laboratoire. Sans confirmation en laboratoire, le diagnostic d'ACI ne peut être posé que dans les cas où il existe des données épidémiologiques clairement établies (dans les foyers d'infection et dans les foyers de maladies groupés déchiffrés en laboratoire chez la majorité des patients).

Pour le diagnostic final, des méthodes de recherche bactériologiques, virologiques et sérologiques sont utilisées. La méthode scatologique, ainsi que les résultats de la sigmoïdoscopie (pour la shigellose), ont une valeur auxiliaire.

je. Méthode bactériologique est de la plus haute importance dans les infections intestinales aiguës causées par la flore bactérienne (diarrhée invasive et sécrétoire). Les meilleurs résultats sont obtenus en semant les selles directement au chevet du patient, avant de prescrire un traitement antibactérien et de le remettre au laboratoire de bactériologie dans les deux heures suivant le prélèvement. Pour la recherche, il faut sélectionner des particules contenant des impuretés pathologiques, mais pas du sang. Le biomatériau est inoculé sur des milieux sélectifs de Ploskirev, Levin, etc. Un résultat négatif de l'examen bactériologique des selles est donné le 3-5ème jour et un résultat positif, en règle générale, le 5-7ème jour à partir du moment où le le matériel est livré au laboratoire de bactériologie. Fréquence des résultats positifs (culture de l'agent pathogène et son identification), même en présence de manifestations cliniques typiques d'infections intestinales aiguës. Ne dépasse pas 70-80%.

II. Méthodes sérologiques les diagnostics sont généralement utilisés dans les cas douteux et avec des résultats négatifs de l'examen bactériologique des selles. Chez les enfants du premier mois. Dans la vie, ce n'est pas très informatif, mais dans tous les cas, une augmentation du titre d'anticorps de 4 fois ou plus est importante. Ils sont effectués dans deux directions : déterminer le titre d’anticorps spécifiques dans le sérum sanguin du patient et l’antigène dans les selles.

Pour déterminer le titre d'anticorps spécifiques, le RNGA est généralement utilisé, moins souvent le RPGA ou le RA. Une suspension d'une culture quotidienne de bactéries (RA) ou d'un diagnostic érythrocytaire est prise comme antigènes. ( RPGA, RNGA). Une augmentation des titres d’anticorps au cours de la maladie doit être considérée comme plus fiable. Des anticorps spécifiques dans le sang d'un patient atteint d'une infection intestinale aiguë apparaissent au 3-5ème jour de la maladie et augmentent jusqu'à un maximum en 2-3 semaines, puis diminuent progressivement. Chez les jeunes enfants, en particulier avec des antécédents prémorbides modifiés, les anticorps spécifiques dans le sang ne sont pas détectés ou ont des titres faibles (1:50 – 1:100).

En présence de symptômes cliniques typiques et de détection d'un titre diagnostique d'anticorps spécifiques (1:200) et plus avec le diagnostic approprié), ou d'une augmentation de leur titre dans la dynamique de la maladie, le diagnostic clinique d'infection intestinale doit être considéré comme établi même en l’absence d’ensemencement de l’agent pathogène à partir des selles du patient.

III. Méthodes de diagnostic express les infections intestinales sont basées sur la détection de l'antigène pathogène (bactérie ou virus) dans les selles, pour laquelle la méthode directe des anticorps luminescents (DMLA) ou la méthode d'immunoadsorption - réaction d'agglomération du carbone (CAR) est utilisée. Le résultat préliminaire peut être obtenu en 2-3 heures, le résultat final en une journée. La spécificité de la méthode est de 82 à 94,6 %.

Ces dernières années, le test immuno-enzymatique (ELISA) et le test d'agglutination au latex (LAR) ont été utilisés pour le diagnostic rapide de la diarrhée.

Le décryptage étiologique des diarrhées virales est réalisé à l'aide de méthodes virologiques et bactériologiques.

La période optimale pour détecter les virus dans les selles est considérée comme allant du 1er au 4ème jour de la maladie, bien que l'agent pathogène persiste souvent plus longtemps.

La principale méthode utilisée est la microscopie électronique, qui permet d'identifier un large éventail d'agents viraux responsables de la gastro-entérite en fonction de leurs caractéristiques morphologiques.

L'immunomicroscopie électronique est également utilisée (basée sur la capacité des particules virales en présence de sérums homologues ou de sérums de convalescence à former des agrégats de particules de rotavirus avec des immunoglobulines.

Parmi les méthodes traditionnelles de sérodiagnostic figurent la réaction de neutralisation, l'inhibition de l'hémagglutination et la fixation du complément. Une augmentation de deux à quatre fois des anticorps dans des sérums appariés a une signification rétrospective pour le diagnostic de l'infection à rotavirus. Pour détecter les rotavirus ou leurs antigènes, l'ELISA, la précipitation diffuse, l'agglutination au latex et la réaction de coagglutination sont utilisées.

Dans les travaux pratiques, l'ELISA a pris la place la plus répandue – isolement des antigènes du rotavirus dans des coprofilteurs. Il est préférable d'utiliser ces méthodes dans la durée (le premier jour d'hospitalisation et après la guérison clinique).

Afin d'exclure l'étiologie bactérienne des infections intestinales aiguës, un examen bactériologique des selles est réalisé par inoculation sur milieu nutritif

Sigmoïdoscopie la méthode est rarement utilisée chez les enfants, principalement pour déterminer la cause de l'excrétion bactérienne prolongée et diagnostiquer les formes prolongées et chroniques de la maladie. Cette méthode d'examen permet d'évaluer uniquement la nature des modifications morphologiques des muqueuses de l'intestin distal, mais ne peut être utilisée pour poser un diagnostic étiologique d'infection intestinale.

Les indications d'un examen instrumental (échographie, examen radiographique des organes abdominaux, FGS) pour les infections intestinales aiguës sont la nécessité d'un diagnostic différentiel avec les maladies chirurgicales des organes abdominaux (intussusception, appendicite), les maladies somatiques (gastrite, ulcère gastroduodénal, cholécystopancréatite, etc.) et troubles fonctionnels tractus gastro-intestinal.

Détermination de la forme clinique de la toxicose (neurotoxicose, toxicose avec exicose, ITS), de son degré (stade), du type de déshydratation dans les diarrhées infectieuses chez l'enfant et prise en charge d'urgence