Le diagnostic des maladies infectieuses est nécessaire à la mise en œuvre ultérieure d'une thérapie étiotrope adéquate visant à détruire l'agent causal du processus pathologique. La détection et l'identification des micro-organismes pathogènes sont effectuées à l'aide de diverses techniques de diagnostic en laboratoire, dont les tests bactériologiques.

La bactériologie en tant que science développée en XIXème siècle grâce à l’introduction de techniques de recherche bactériologique.

Le principe et l'essence de la technique

L'objectif principal de la recherche bactériologique est la détection et l'identification ultérieure d'un micro-organisme pathogène (causant une maladie) dans le matériau étudié. Pour ce faire, l'inoculation est effectuée sur des milieux nutritifs spéciaux (bouillon viande-peptone, milieu gélose solide), sur lesquels, en présence d'un agent pathogène dans le matériau, des colonies de micro-organismes se développent après un certain temps. Ils sont identifiés par des critères microscopiques (taille des cellules, leur forme, une certaine couleur lors de la coloration selon Gram), biochimiques (capacité à décomposer certains glucides ou
protéines) et antigéniques (interaction avec les anticorps dirigés contre les principales classes d'agents pathogènes). En général, cette technique de diagnostic nécessite de 48 à 72 heures, ce qui est assez long (surtout s'il faut débuter rapidement un traitement étiotrope d'une pathologie infectieuse). Néanmoins, ce type de diagnostic de laboratoire ne perd pas de sa pertinence aujourd'hui, car il est fiable pour un grand nombre de maladies infectieuses.

Très souvent, lors d'une étude bactériologique, la sensibilité du micro-organisme pathogène isolé aux principaux groupes d'antibiotiques modernes est en outre déterminée. Cela permet de sélectionner ultérieurement la thérapie étiotrope la plus efficace.

Quand réalise-t-on le diagnostic bactériologique ?

L'indication pour mener une étude bactérienne est le diagnostic de diverses maladies infectieuses, parmi lesquelles :

En outre, cette technique peut être utilisée pour déterminer l'agent causal de processus purulents de diverses localisations. Tout d'abord, cela est nécessaire pour déterminer la sensibilité des micro-organismes identifiés aux antibiotiques, car avec le développement d'un processus purulent, les agents pathogènes deviennent souvent résistants à la plupart des antibiotiques.

Le diagnostic de dysbactériose par examen bactériologique permet de déterminer le type de micro-organismes opportunistes, ainsi que leur quantité, sur la base desquels une conclusion est tirée sur la gravité de la perturbation de la microflore normale.

Le matériel utilisé pour l'examen bactériologique est l'urine, le sang, les prélèvements de la cavité nasale, de l'urètre, du vagin, du rectum, des selles, du sperme chez l'homme et des crachats. Le choix du matériel dépend des indications de cette méthode de diagnostic en laboratoire et de la localisation du processus pathologique.

Décoder les résultats

Dans la plupart des cas, le résultat de l'étude est basé sur 2 indicateurs - le fait de la présence de substances détectables
microorganisme (résultat positif ou négatif), ainsi que le nombre de cellules bactériennes par unité de volume du matériau testé (cet indicateur n'apparaît qu'avec un résultat positif). L'abondance bactérienne est exprimée en nombre d'unités formant colonie (UFC). Plus cet indicateur est élevé, plus le nombre de bactéries dans le matériau à tester est élevé. Le résultat peut également inclure des indicateurs de sensibilité du micro-organisme identifié aux antibiotiques. Il s'agit généralement d'une liste des principales classes d'agents antibactériens (

20. Caractéristiques de la méthode de recherche bactériologique

La méthode de recherche culturelle (bactériologique) est un ensemble de méthodes visant à isoler et à identifier des cultures pures de micro-organismes (bactéries) en utilisant la culture sur milieu nutritif.

La culture pure est un ensemble de micro-organismes de la même espèce. Le plus souvent, une culture pure est obtenue en sélectionnant et en cultivant une colonie isolée (la progéniture d’une seule cellule microbienne).

Étapes de la méthode :

1. Collecte de matériel pour la recherche.

2. Isolement de la culture pure et son identification.

3. Conclusion.

Collecte de matériel pour la recherche. Le type de matériel étudié dépend du but de l'étude (diagnostic - du patient ; analyse épidémiologique - du milieu extérieur, de l'aliment, du patient et (ou) porteur de bactéries).

Isolement de la culture pure. Comprend 3 ou 4 étapes :

1. Inoculation du matériel (après microscopie préalable) sur boîte avec un milieu nutritif solide (de préférence diagnostique différentiel ou sélectif) afin d'obtenir des colonies isolées. Il est le plus souvent produit par séparation mécanique. Dans certains cas (par exemple le sang), le matériel est pré-inoculé dans un milieu d'enrichissement liquide puis transféré dans une plaque avec un milieu gélose. Parfois, avant le semis, un traitement sélectif du matériau est effectué (en tenant compte des propriétés du micro-organisme isolé ; par exemple, traitement à l'acide ou à l'alcali pour isoler les bactéries résistantes). Cultiver à une température de 37°C pendant 18-24 heures. Les temps de culture peuvent varier selon les types de bactéries.

2(3) :a) étude des colonies sur plaque de gélose (caractéristiques culturelles), sélection des plus typiques ; b) préparer des frottis de ces colonies avec coloration (méthode de Gram ou autres) ; a) filtrer le reste de la colonie étudiée sur un milieu d'accumulation et la faire croître dans un thermostat à la température optimale.

3(4). Etude de la pureté de la culture obtenue sur le milieu d'accumulation. Avec ça

un frottis est préparé, coloré (généralement avec une coloration de Gram) et examiné au microscope

homogénéité morphologique et tinctoriale (dans différents champs de vision).

4(5). Identification de la culture pure.

Conclusion. Sur la base de l'ensemble des caractéristiques par rapport aux propriétés des souches de référence (type), le type de micro-organisme isolé du matériau est indiqué.

Évaluation de la méthode :

avantages : sensibilité et précision relativement élevées, capacité à déterminer le nombre de microbes dans le matériel de test, ainsi que la sensibilité aux antibiotiques ; défauts: durée relative, la méthode est coûteuse.

21. Milieux nutritifs pour aérobies et anaérobies. Exigences relatives aux milieux nutritifs, classification.

Exigences:

les médias doivent être nutritifs

doit avoir un certain pH

doit être isotonique, c'est-à-dire La pression osmotique dans l'environnement doit être la même que dans la cellule.

doit être humide et pas trop liquide

doit avoir un certain potentiel redox

doit être stérile

doit être unifié, c'est-à-dire contiennent des quantités constantes d’ingrédients individuels.

Les milieux nutritifs peuvent être divisés :

A) Par origine :

1) naturel - produits alimentaires naturels (viande, lait, pommes de terre) ;

2) artificiel - préparé spécifiquement pour la culture de microbes : - milieux à base de produits naturels (eau de viande, bouillon d'extrait de viande (MPB), gélose à l'extrait de viande (MPA), - n'ayant pas de composition constante ; - milieux nutritifs synthétiques - solutions de strictement des quantités définies de sels, d'acides aminés, de bases azotées, de vitamines dans l'eau distillée - ont une composition constante, sont utilisées pour la croissance de micro-organismes et de cultures cellulaires afin d'obtenir des vaccins, des sérums immunitaires et des antibiotiques ;

B) Par finalité :

1) usage général (MPB, MPA) - la plupart des microbes s'y développent ;

2) sélectif - favoriser sélectivement la croissance d'un type de microbe à partir d'un mélange (par exemple, gélose jaune-sel pour les staphylocoques) ;

3) diagnostic différentiel - ils permettent de différencier un type de microbe des autres par l'apparence du milieu (par exemple, Endo, environnements de Levin pour le groupe de microbes intestinaux).

De plus, selon fins d'utilisation Dans le schéma d'isolement des cultures pures, les milieux suivants peuvent être distingués par leur destination :

1) enrichissement - supprimer la croissance des microbes accompagnant l'agent pathogène ;

2) obtenir des colonies isolées ;

3) accumulation de culture pure ;

B) Par cohérence :

1) liquide ;

2) semi-liquide (avec ajout d'agar-agar à une concentration de 0,5 à 0,7 %) ;

3) dense - supérieur à 1%.

Méthode bactériologique comprend la bactérioscopie du matériel du patient, l'isolement d'une culture pure de l'agent pathogène et son identification avec détermination de la sensibilité aux antibiotiques et à la chimiothérapie.

Sélection des matériaux car la recherche par méthode bactérioscopique dépend de l'étiologie attendue de la maladie, du stade de la maladie, en tenant compte de sa pathogenèse, des propriétés biologiques de l'agent pathogène et d'autres points.
1. Pour les maladies infectieuses survenant avec une bactériémie (fièvre typhoïde, formes généralisées et septiques de salmonellose); en cas de sepsis de toute étiologie, provoqué non seulement par la microflore coccique pyogène, Pseudomonas aeruginosa, mais également par ses agents pathogènes plus rares (Serratia Salinaria, bactéries non fermentantes, anaérobies, formes L de streptocoque (méthode de Suknev) et autres micro-organismes) , en recourant dans ces cas à des cultures sur milieux nutritifs spéciaux. Il convient de souligner que le succès de la fréquence et de la gamme d'agents pathogènes isolés du sang et d'autres sécrétions biologiques du patient dépend de l'érudition, de la curiosité, de la persévérance et de la persévérance des travailleurs du laboratoire de bactériologie.
2. Liquide céphalo-rachidien (méningite purulente ; méningite tuberculeuse en culture de longue durée (plus d'un mois) sur milieu nutritif spécial pour isoler les bactéries tuberculeuses.
3. Crachats (pneumonie aiguë et trachéobronchite, tuberculose, coqueluche, peste, formes rares de fièvre typhoïde (fièvre pneumotyphoïde), légionellose, mycoplasmose respiratoire et chlamydia).
4. Mucus, pus des amygdales (amygdalite streptococcique et staphylococcique).

5. Plaque et mucus des amygdales, de la gorge et du nez, écoulement de la conjonctive, des organes génitaux (diphtérie).
6. Grattage de la muqueuse nasale (lèpre).
7. Écoulement du nez et de l'oropharynx (sinusite, ozène, rhinosclérome).

8. Liquide d'œdème, morceaux de muscles affectés, tissus nécrotiques (infections anaérobies) ; écoulement de la plaie (botulisme ; si nécessaire, tétanos).
9. Ponction due à une hypertrophie des ganglions lymphatiques (tuberculose, toxoplasmose).
10 Contenu de l'anthrax et ponctué des ganglions lymphatiques suppurés (peste, tularémie, septicopyémie, charbon).

Etudes bactériologiques pour les infections particulièrement dangereuses (peste, tularémie, brucellose, choléra (dans lesquelles seules les matières fécales sont examinées (!))) sont réalisées dans des laboratoires spéciaux de haute sécurité qui excluent la possibilité d'auto-infection de ses employés lorsqu'ils travaillent avec des cultures bactériennes et le propagation d’agents pathogènes en dehors de ces laboratoires.

Etudes sérologiques. Elles ont été introduites en clinique un peu plus tard que la méthode bactériologique proposée par R. Koch. En 1896, F. Vidal découvrit que le sérum sanguin des patients atteints de fièvre typhoïde, à la fin de la 1ère semaine de maladie, acquiert la capacité d'agglutiner le bacille typhoïde, l'agent causal de la fièvre typhoïde (réaction de Vidal positive). Avec l'étiologie polymicrobienne des maladies infectieuses, après la découverte de Widal, ils ont également commencé à recourir à la détermination des titres d'agglutinines sériques de plusieurs types de bactéries isolées du matériel pathologique (réaction autovidale) et à surveiller leur dynamique en fonction du stade de la maladie. Les titres les plus élevés d'agglutinines pour l'un des types de bactéries isolées indiquent sa plus grande implication étiologique dans le développement de la maladie.

Déjà au début application de la réaction de Widal En clinique, il a été constaté que les formes les plus graves, par exemple la fièvre typhoïde, peuvent survenir en l'absence d'agglutinines dans le sang (réaction de Widal négative), ce qui indique la valeur diagnostique relative de cette méthode tant pour la fièvre typhoïde que pour la fièvre typhoïde. pour d'autres maladies infectieuses. Elle a ensuite été remplacée par des méthodes sérologiques plus sensibles. Mais la priorité de la découverte de Vidal restera à jamais.

Actuellement pour diagnostic sérologique Pour les infections bactériennes, des méthodes plus sensibles sont utilisées lorsque l'antigène bactérien est sorbé à la surface des érythrocytes (diagnostic érythrocytaire1). Ainsi, des réactions sérologiques fondamentalement nouvelles ont été développées : hémagglutination directe (RPHA) et indirecte (RIHA). Ils sont largement utilisés pour le diagnostic sérologique de nombreuses infections bactériennes, virales et autres (fièvre typhoïde, salmonellose, shigellose, brucellose, tularémie, etc.). La réaction de précipitation conserve sa valeur diagnostique dans certaines maladies (botulisme et charbon - réaction d'Ascoli pour son diagnostic chez l'animal). En sérodiagnostic, la réaction de fixation du complément (FFR), proposée en 1901 par les chercheurs français Bordet et Zhangou (syphilis, gonorrhée, brucellose, toxoplasmose, tuberculose, lèpre, morve), est actuellement particulièrement utilisée. La RSC est de la plus haute importance pour le sérodiagnostic des infections virales (grippe, autres infections virales respiratoires aiguës, herpès, encéphalite, oreillons, psittacose, etc.), ainsi que de nombreuses rickettsioses.

La principale méthode de diagnostic microbiologique et la « référence » de la microbiologie est la méthode bactériologique.

Le but de la méthode bactériologique consiste à isoler une culture pure du pathogène du matériel à tester, à accumuler une culture pure et à identifier cette culture par un ensemble de propriétés : morphologiques, tinctoriales, culturelles, biochimiques, antigéniques, par la présence de facteurs de pathogénicité, de toxigénicité et déterminer sa sensibilité aux médicaments antimicrobiens et aux bactériophages.

La méthode de recherche bactériologique comprend :

1. inoculation du matériel d'essai dans un milieu nutritif

2. isolement de la culture pure

3. identification des micro-organismes (détermination des espèces).

L'isolement et l'identification de cultures pures de bactéries aérobies et anaérobies impliquent les études suivantes :

Étape I (travailler avec du matériel natif)

Objectif : obtenir des colonies isolées

1. La microscopie préliminaire donne une idée approximative de la microflore

2. Préparation du matériel pour la recherche (dilution avec une solution isotonique de NaCl, etc.)

3. Semis sur milieu nutritif solide pour obtenir des colonies isolées

4. Incubation à température optimale, le plus souvent 37°C, pendant 18 à 24 heures

Étape II

Objectif : obtenir une culture pure

1. Etude macroscopique colonies en lumière transmise et réfléchie (caractéristiques de taille, forme, couleur, transparence, consistance, structure, contour, surface des colonies).

2. Examen microscopique de colonies isolées

3. Test d'aérotolérance (pour confirmer la présence d'anaérobies stricts dans le matériel d'essai).

4. Ensemencement de colonies caractéristiques d'une espèce particulière sur des milieux d'accumulation de culture pure ou sur milieux sélectifs et incubation dans des conditions optimales.

Stade III

Objectif : identification de cultures pures isolées

1. Pour identifier la culture sélectionnée sur la base d'un ensemble de propriétés biologiques, les éléments suivants sont étudiés :

· morphologie et propriétés tinctoriales

· biens culturels (caractère de croissance sur milieux nutritifs)

· propriétés biochimiques (activité enzymatique des micro-organismes, activités glycolytiques, protéolytiques et autres)

Propriétés sérologiques (antigéniques)

· propriétés virulentes (capacité à produire des facteurs de pathogénicité : toxines, enzymes, facteurs de défense et d'agression)

pathogénicité pour les animaux

· phagolysabilité (sensibilité aux bactériophages diagnostiques)

sensibilité aux antibiotiques

· autres propriétés individuelles

Stade IV (Conclusion)

Sur la base des propriétés étudiées, une conclusion est tirée sur la culture sélectionnée.

La première étape de la recherche. L'examen du matériel pathologique commence par la microscopie. La microscopie du matériel natif coloré permet d'établir approximativement la composition du paysage microbien de l'objet étudié et certaines caractéristiques morphologiques des micro-organismes. Les résultats de la microscopie du matériel natif déterminent en grande partie le déroulement des recherches ultérieures ; ils sont ensuite comparés aux données obtenues par inoculation sur milieux nutritifs.

Si l'échantillon contient une teneur suffisante en micro-organismes pathogènes, l'inoculation est réalisée sur un milieu nutritif solide (pour obtenir des colonies isolées). S'il y a peu de bactéries dans le matériel d'essai, l'inoculation est effectuée sur un milieu nutritif enrichi en liquide. Les milieux nutritifs sont sélectionnés en fonction des besoins des micro-organismes.

La culture de micro-organismes n'est possible que si des conditions optimales pour leur vie sont créées et si des règles sont respectées qui excluent la contamination (contamination accidentelle par des microbes étrangers) du matériel étudié. Des conditions artificielles qui empêcheraient la contamination de la culture par d'autres espèces peuvent être créées dans un tube à essai, une fiole ou une boîte de Pétri. Toute la verrerie et les milieux de culture doivent être stériles et, après inoculation du matériel microbien, protégés de la contamination externe, obtenue à l'aide de bouchons ou de capsules et couvercles métalliques. Les manipulations avec le matériau d'essai doivent être effectuées dans la zone de flamme d'une lampe à alcool pour éviter la contamination du matériau par l'environnement extérieur, ainsi que dans le but de se conformer aux règles de sécurité.

L'inoculation du matériel sur milieu nutritif doit être effectuée au plus tard 2 heures après la collecte.

Deuxième étape de recherche. Etude des colonies et isolement des cultures pures. Après une journée d'incubation, les colonies se développent sur les boîtes, et au premier coup la croissance est continue, et aux coups suivants - des colonies isolées. Une colonie est un ensemble de microbes de la même espèce se développant à partir d’une seule cellule. Le matériau étant le plus souvent un mélange de microbes, plusieurs types de colonies se développent. Marquez différentes colonies avec un crayon, en les délimitant d'un cercle à partir du bas, et étudiez-les (Tableau 12). Tout d’abord, les colonies sont étudiées à l’œil nu : signes macroscopiques. La coupelle est vue (sans l'ouvrir) par le bas en lumière transmise, on constate la transparence des colonies (transparente, si elle ne bloque pas la lumière ; translucide, si elle bloque partiellement la lumière ; opaque, si la lumière ne passe pas à travers le colonie), et la taille des colonies est mesurée (en mm). Puis ils étudient les colonies du côté de la paupière, notent la forme (ronde régulière, irrégulière, plate, convexe), la nature de la surface (lisse, brillante, terne, rugueuse, ridée, humide, sèche, visqueuse), la couleur. (incolore, coloré).

Tableau 12. Schéma d'étude des colonies

Remarque : les points 5 à 7 sont étudiés à faible grossissement au microscope ou à la loupe.

Vous pouvez encore mieux voir les différences entre les colonies en les regardant avec un grossissement. Pour ce faire, placez une coupelle fermée bas vers le haut sur la platine, abaissez légèrement le condenseur, utilisez un léger grossissement de l'objectif (x8), en déplaçant la coupelle, étudiez les caractéristiques microscopiques des colonies : la nature du bord ( lisse, ondulée, dentelée, festonnée), structure (homogène, granuleuse, fibreuse, homogène ou différente au centre et en périphérie).

Ensuite, la morphologie des cellules microbiennes des colonies est étudiée. Pour ce faire, des frottis sont réalisés à partir d'une partie de chacune des colonies marquées et colorés au Gram. Lors du prélèvement des colonies, faire attention à leur consistance (sèche, si la colonie s'effrite et est difficile à ramasser ; molle, si elle se prend facilement avec une anse ; visqueuse, si la colonie est tirée par une anse ; dure, si elle fait partie de la colonie n'est pas prise avec une boucle, vous ne pouvez supprimer que la colonie entière) .

Lors de l'examen des frottis, il est établi que la colonie est représentée par un type de microbe. Des cultures pures de bactéries peuvent donc être isolées. Pour ce faire, les colonies étudiées sont réensemencées sur gélose inclinée. Lors du réensemencement à partir de colonies, il faut veiller à prélever exactement les colonies prévues, sans toucher les colonies voisines avec la boucle. Les tubes sont étiquetés et incubés dans un thermostat à 37°C pendant 24 heures.

La troisième étape de la recherche. Identification de la culture isolée. Identification des microbes - détermination de la position systématique d'une culture isolée d'un matériau à une espèce et une variante. La première condition d’une identification fiable est la pureté inconditionnelle de la culture. Pour identifier les microbes, un ensemble de caractéristiques est utilisé : morphologiques (forme, taille, présence de flagelles, capsules, spores, position relative dans un frottis), tinctoriales (relation avec la coloration de Gram ou autres méthodes), chimiques (rapport guanine + cytosine dans une molécule d'ADN), culturel (besoins nutritionnels, conditions de culture, vitesse et nature de croissance sur différents milieux nutritifs), enzymatique (dégradation de diverses substances avec formation de produits intermédiaires et finaux), sérologique (structure antigénique, spécificité), biologique (virulence pour les animaux, toxigénicité, allergénicité, effet des antibiotiques, etc.).

Pour la différenciation biochimique, ils étudient la capacité des bactéries à fermenter les glucides avec formation de produits finaux intermédiaires, la capacité à décomposer les protéines et les peptones et étudient les enzymes rédox.

Etudier les enzymes saccharolytiques les cultures isolées sont inoculées dans des tubes à essai avec des milieux semi-liquides contenant du lactose, du glucose et d'autres glucides et alcools polyhydriques. Pour les milieux semi-liquides, l'inoculation se fait par injection en profondeur du milieu. Lors du semis par injection, le tube à essai contenant le milieu est maintenu incliné, le bouchon est retiré et le bord du tube à essai est brûlé. Le matériel est prélevé avec une anse stérile et la colonne de milieu nutritif en est percée presque jusqu'au fond.

Pour la détermination des enzymes protéolytiques la culture isolée est ensemencée sur eau peptonée ou MPB. Pour ce faire, prenez dans votre main le tube à essai avec l'inoculation le plus proche de vous, et le tube à essai avec le milieu plus éloigné de vous. Les deux tubes à essai sont ouverts en même temps, en saisissant leurs bouchons avec le petit doigt et le bord de la paume, en brûlant les bords des tubes à essai, à l'aide d'une anse calcinée et refroidie, pour saisir un peu de culture et le transférer dans le deuxième tube à essai. , broyez-le dans un milieu liquide sur la paroi du tube à essai et rincez-le avec le milieu.

Lors du semis et du réensemencement, il convient de veiller au respect des règles de stérilité, afin de ne pas contaminer vos cultures par une microflore étrangère, et également de ne pas polluer l'environnement. Les tubes sont étiquetés et placés dans un thermostat pour incubation à 37°C pendant 24 heures.

Conclusion

Comptabilisation des résultats. Conclusion de l'étude. Les résultats de l'identification sont pris en compte et, sur la base de l'ensemble des données obtenues, sur la base de la classification et des caractéristiques des souches typiques décrites dans le manuel (clé de Burgee, 1994-1996), le type de cultures isolées est déterminé.

Méthode de recherche bactériologique (BLMI)– une méthode basée sur l'isolement de cultures pures de bactéries par culture sur milieux nutritifs et leur identification aux espèces basée sur l'étude des caractéristiques morphologiques, culturelles, biochimiques, génétiques, sérologiques, biologiques et environnementales des micro-organismes.

Le diagnostic bactériologique des infections est effectué à l'aide de schémas de diagnostic standard approuvés par le ministère de la Santé.

Culture pure – bactéries d'une espèce cultivées sur un milieu nutritif dont les propriétés sont à l'étude.

Souche– une culture pure identifiée de micro-organismes d’une espèce, isolée d’une source spécifique à un moment précis. Les souches d'une même espèce peuvent différer de manière insignifiante par leurs propriétés biochimiques, génétiques, sérologiques, biologiques et autres, ainsi que par le lieu et le moment de l'isolement.

Objectifs BLMI :

1. Poser un diagnostic étiologique : isoler une culture pure de micro-organismes et l'identifier.

2. Détermination de propriétés supplémentaires, par exemple la sensibilité d'un micro-organisme aux antibiotiques et aux bactériophages.

3. Détermination du nombre de micro-organismes (important dans le diagnostic des infections causées par l'UPM).

4. Typage des micro-organismes, c'est-à-dire détermination des différences intraspécifiques sur la base de l'étude génétique Et épidémiologique(phagovars et sérovars) Marqueurs. Ceci est utilisé à des fins épidémiologiques, car il permet d'établir la communauté de micro-organismes isolés de différents patients et de différents objets environnementaux dans différents hôpitaux et régions géographiques.

BLMI comprend plusieurs étapes, différent pour les aérobies, les anaérobies facultatifs et les anaérobies obligatoires.

I. Étapes du BLMI dans l'isolement d'une culture pure d'aérobies et d'anaérobies facultatifs.

Scène.

A. Collecte, transport, stockage, prétraitement du matériel. Parfois, avant le semis, un traitement sélectif du matériau est effectué, en tenant compte des propriétés du micro-organisme isolé. Par exemple, avant d'examiner les crachats ou tout autre matériel pour détecter la présence de Mycobacterium tuberculosis acido-résistant, le matériel est traité avec des solutions d'acides ou d'alcalis.

B. Semis en milieu d'enrichissement(si nécessaire) Elle est effectuée si le matériel de test contient un petit nombre de bactéries, par exemple lors de l'isolement d'une hémoculture. Pour ce faire, du sang prélevé au plus fort de la fièvre dans un grand volume (8 à 10 ml chez l'adulte, 4 à 5 ml chez l'enfant) est inoculé au milieu dans un rapport de 1:10 (pour vaincre l'effet du sang bactéricide facteurs); la culture est incubée à une température de 37 0 C pendant 18 à 24 heures.

B. Microscopie du matériel étudié. Un frottis est préparé à partir du matériau examiné, coloré au Gram ou par une autre méthode et examiné au microscope. La microflore présente et sa quantité sont évaluées. Des études complémentaires devraient isoler les micro-organismes présents dans le frottis initial.

D. Semis sur milieu nutritif pour obtenir des colonies isolées. Le matériel est inoculé à l'anse ou à la spatule selon la méthode de séparation mécanique sur boîte avec un milieu de diagnostic différentiel ou sélectif afin d'obtenir des colonies isolées. Après le semis, la coupelle est retournée (pour éviter de maculer les colonies de gouttelettes de liquide de condensation), étiquetée et placée dans un thermostat à une température de 37 0 C pendant 18 à 24 heures.

Il ne faut pas oublier que lors du semis et du réensemencement de cultures microbiennes, l’attention du travailleur doit être portée au respect des règles d’asepsie pour éviter la contamination des milieux nutritifs et prévenir l’infection d’autrui et l’auto-infection !

Dans le cas d'infections causées par des micro-organismes opportunistes, où le nombre de micro-organismes présents dans le matériel pathologique est important, un ensemencement quantitatif du matériel est effectué, pour lequel une série de dilutions au 100 fois du matériel (généralement 3 dilutions) dans un Une solution stérile isotonique de chlorure de sodium dans des tubes à essai est d'abord préparée. Ensuite, 50 µl de chaque dilution sont ensemencés sur milieux nutritifs en boîtes de Pétri.

Scène.

A. Etude des morphotypes des colonies sur milieux, leur microscopie. Ils examinent les plats et notent le milieu nutritif optimal, le taux de croissance et le modèle de croissance des micro-organismes. Choisissez d'étudier colonies isolées situées le long du trait, plus près du centre. Si plusieurs types de colonies se développent, chacun est examiné séparément. Les signes de colonies sont évalués (Tableau 7). Si nécessaire, les plats contenant des cultures sont examinés à la loupe ou à l'aide d'un microscope doté d'un objectif à faible grossissement et d'un diaphragme rétréci. Les propriétés tinctoriales de différents morphotypes de colonies sont étudiées ; pour cela, une partie de la colonie étudiée est préparée diffamer, coloré par Gram ou d'autres méthodes, au microscope et déterminé la morphologie et la pureté de la culture. Si nécessaire, mettre RA approximatif sur verre avec des sérums polyvalents.

B. Accumulation de culture pure. Pour accumuler une culture pure, des colonies isolées de tous morphotypes sont réensemencées dans des tubes séparés avec de la gélose inclinée ou un autre milieu nutritif et incubées dans un thermostat à +37 0 C (cette température est optimale pour la plupart des micro-organismes, mais elle peut être différente, par exemple). exemple, Campylobactérie spp.– +42 0 C, Candida spp. et Yersinia pestis– +25 0 C).

Le milieu de Kligler est généralement utilisé comme milieu d'accumulation pour les entérobactéries.

Composition du milieu de Kligler : MPA, 0,1% glucose, 1% lactose, réactif sulfure d'hydrogène (sulfate ferreux + thiosulfate de sodium + sulfite de sodium), indicateur rouge de phénol. La couleur initiale du milieu est rouge pourpre, le milieu est « incliné » dans des éprouvettes : il présente une colonne (2/3) et une surface inclinée (1/3).

Le semis en milieu Kligler se fait par stries en surface et piquage en colonne.

Scène.

A. Comptabilisation de la croissance sur milieu d'accumulation, évaluation de la pureté de la culture dans un frottis de Gram. Patterne de croissance culture pure isolée. Une culture visuellement pure se caractérise par une croissance uniforme. À examen microscopique Un frottis coloré préparé à partir d'une telle culture révèle des cellules morphologiquement et tinctorialement homogènes dans différents champs de vision. Cependant, dans le cas d'un pléomorphisme prononcé inhérent à certains types de bactéries, les frottis issus d'une culture pure peuvent contenir simultanément des cellules de morphologies différentes.

Si le milieu indicateur de Kligler a été utilisé comme milieu d'accumulation, les changements de couleur dans la colonne et la partie inclinée sont évalués, qui sont utilisés pour déterminer les propriétés biochimiques : fermentation du glucose, production de lactose et de sulfure d'hydrogène. Lorsque le lactose se décompose, la partie inclinée du milieu devient jaune et lorsque le glucose se décompose, la colonne devient jaune. Lorsque du CO 2 se forme lors de la décomposition des sucres, des bulles de gaz ou une rupture de colonne se forment. Dans le cas de la production de sulfure d'hydrogène, un noircissement est constaté le long de la voie d'injection en raison de la conversion du sulfate ferreux en sulfure ferreux.

La nature du changement de couleur dans le milieu de Kligler (Fig. 23) s'explique par l'intensité inégale de la dégradation des substances azotées par les micro-organismes et la formation de produits alcalins en conditions aérobies (sur surface inclinée) et anaérobies (en colonne). .

Dans des conditions aérobies, une formation d'alcalis plus intense se produit sur la surface biseautée que dans la colonne du milieu. Ainsi, lors de la décomposition du glucose, présent en faible quantité dans le milieu, l'acide formé sur la surface biseautée est rapidement neutralisé. Parallèlement, lors de la décomposition du lactose, présent en forte concentration dans le milieu, les produits alcalins ne sont pas capables de neutraliser l'acide.

Dans des conditions anaérobies dans la colonne, des produits alcalins se forment en quantités négligeables, c'est pourquoi la fermentation du glucose est détectée ici.

Riz. 23. Milieu indicateur Kligler :

1 – initiale,

2 – avec croissance E. coli,

3– avec croissance S. paratyphi B,

4 – avec la croissance S. typhi

E. coli décompose le glucose et le lactose avec formation de gaz, ne produit pas de sulfure d'hydrogène. Ils provoquent un jaunissement de la colonne et de la partie biseautée avec des cassures du milieu.

S. paratyphi décomposer le glucose avec formation de gaz, lactose négatif. Ils provoquent un jaunissement de la colonne avec cassures ; la partie biseautée ne change pas de couleur et reste pourpre. Où S. paratyphi B produire du sulfure d'hydrogène (une couleur noire apparaît au fur et à mesure de l'injection), S. paratyphi A ne produisent pas de sulfure d’hydrogène.

S. typhi décomposent le glucose sans formation de gaz, sont lactose négatifs, produisent du sulfure d'hydrogène. Ils font jaunir la colonne sans cassure, la partie biseautée ne change pas de couleur et reste pourpre, et une couleur noire apparaît au fur et à mesure de l'injection.

Shigella spp. glucose positif, lactose négatif, ne produit pas de sulfure d'hydrogène. Ils font jaunir la colonne (avec ou sans cassures selon le sérovar), la partie biseautée ne change pas de couleur et reste cramoisie.

B. Identification finale de la culture pure(détermination de la position systématique du micro-organisme isolé au niveau de l'espèce ou du variant) et déterminer le spectre de sensibilité de la culture isolée aux antibiotiques.

Pour identifier une culture pure, les caractéristiques biochimiques, génétiques, sérologiques et biologiques sont étudiées à ce stade (Tableau 8).

Dans la pratique courante en laboratoire, lors de l’identification, il n’est pas nécessaire d’étudier toutes les propriétés. Utiliser des tests informatifs, accessibles et simples, suffisants pour déterminer l’espèce (variante) du micro-organisme isolé.