Энэ хэрэг өнгөрсөн долоо хоногоос эхлэн Германд тархаж, пүрэв гарагийн шөнө өөр эмэгтэй халдвар авсан гэж Гамбург дахь Эппендорф их сургуулийн эмнэлгийн хэвлэлийн төлөөлөгч N-24 телевизээс иш татан мэдэгдэв. Герман дахь халдвар нь гэдэсний гэдэсний савханцар (Escherichia coli) гэж нэрлэгддэг энтерогеморрагик нянгаар үүсгэгдсэн.
Escherichia coli (E. coli) нян нь 1982 оноос хойш АНУ-д дэгдэлт гарсны дараа нийгмийн эрүүл мэндийн асуудал гэж хүлээн зөвшөөрөгдсөн.
E. coli нь ихэвчлэн хүн, халуун цуст амьтдын гэдэс дотор байдаг. E. coli-ийн ихэнх омгууд нь хоргүй байдаг. Гэсэн хэдий ч enterohemorrhagic E. coli (EHEC) зэрэг зарим омгууд нь хоол хүнсээр дамжих хүнд өвчин үүсгэдэг. Энэ нян хүнд голчлон түүхий болон дутуу болгосон мах, түүхий сүү зэрэг бохирдсон хоол хүнс хэрэглэснээр дамждаг.
EHEC нь веротоксин буюу Шигагийн хорт бодис гэж нэрлэгддэг хорт бодисыг үүсгэдэг бөгөөд тэдгээр нь шигелла цусан суулга бактерийн үүсгэсэн хорт бодисуудтай ижил төстэй байдаг тул ийнхүү нэрлэжээ.
EHEC бактерийн тоо нь +7-аас +50 ° C (хамгийн оновчтой температур + 37 ° C) температурт нэмэгдэж болно. Зарим EHEC бактери нь хүчиллэг хоолонд нэмэгдэж болно.
Бүтээгдэхүүнийг сайтар чанах замаар нян устгадаг - бүтээгдэхүүний бүх хэсгийг 70 ° C ба түүнээс дээш температурт халаах замаар.
EHEC-ээс үүдэлтэй өвчин
EHEC бактериас үүдэлтэй өвчний шинж тэмдэг нь хэвлийн базлалт (хэвлийн эрхтнүүдийн гөлгөр булчингийн агшилт) ба суулгалт, зарим тохиолдолд цусархаг суулгалт (цусархаг колит) болж хувирдаг. Халуурах, бөөлжих боломжтой.
Инкубацийн хугацаа гурваас найман хоног, дунджаар гурваас дөрөв хоног үргэлжилдэг. Ихэнх өвчтөнүүд 10 хоногийн дотор эдгэрдэг боловч цөөн тооны өвчтөнүүдэд (ялангуяа бага насны хүүхэд, өндөр настан) өвчин хүндэрч, амь насанд аюултай - цус задралын уремийн хам шинж (HUS) болно. HUS нь бөөрний цочмог дутагдал, цус задралын цус багадалт (цусны улаан эсийг (эритроцит) устгах нь ясны чөмөгөөр үүсэхээс хурдан явагддаг цус багадалт), тромбоцитопени (ямар ялтасны тоо буурах - 1 тутамд 200 мянгаас бага) зэргээр тодорхойлогддог. куб мм - захын цусан дахь ).
EHEC-ийн халдвартай өвчтөнүүдийн 10% нь HUS-д өртөж болзошгүй бөгөөд нас баралтын хувь 3-5% байдаг. Дэлхий даяар HUS нь бага насны хүүхдүүдэд бөөрний цочмог дутагдлын хамгийн түгээмэл шалтгаан болдог. Энэ нь өвчтөнүүдийн 25% -д мэдрэлийн хүндрэл (таталт, цус харвалт, кома гэх мэт), амьд үлдсэн өвчтөнүүдийн 50% -д нь бөөрний архаг өвчин, ихэвчлэн хөнгөн хэлбэрээр илэрдэг.
EHEC-ийн халдварын тохиолдол нь насны бүлгээс хамаарч өөр өөр байдаг. Өвчний мэдээлэгдсэн хамгийн олон тохиолдол нь 15-аас доош насны хүүхдүүдэд тохиолддог. Өвчний тохиолдлын 63-85% нь хүнсний бүтээгдэхүүнд агуулагдах эмгэг төрүүлэгч бичил биетний хордлогын үр дүнд үүсдэг. HUS-ийн хөгжилд хүргэдэг EHEC халдварын эзлэх хувь нь хааяа тохиолдлын үед 3-7%, дэгдэлтийн үед 20% ба түүнээс дээш байдаг.
Халдварын эх үүсвэр
Энэ эмгэг төрүүлэгч бичил биетний нөөц нь гол төлөв үхэр болон тэмээ зэрэг хивэгч амьтад юм. Хүнд гол төлөв түүхий болон дутуу болгосон мах, түүхий сүү зэрэг бохирдсон хоол хүнс хэрэглэснээр халдварладаг.
Ус болон бусад хүнсний бүтээгдэхүүний ялгадас бохирдох, түүнчлэн хоол бэлтгэх явцад (үхрийн мах болон бусад махан бүтээгдэхүүн, бохирдсон ажлын гадаргуу, гал тогооны хэрэгслээр дамжин) хөндлөн бохирдох зэрэг нь өвчин үүсгэдэг.
Өсөн нэмэгдэж буй дэгдэлт нь жимс, хүнсний ногоо (нахиа, шанцайны ургамал, байцаа, салат) хэрэглэхтэй холбоотой байдаг бөгөөд энэ нь тариалах, боловсруулах явцад гэрийн болон зэрлэг амьтдын ялгадастай харьцсанаас үүсдэг. Мөн EHEC бактери нь усан сан (цөөрөм, гол мөрөн), худаг, малын усны тэвшээс олдсон. Тэд эдгээр усны биетүүд болон ундны тэвшний ёроол дахь тунадас дахь бууцанд хэдэн сарын турш амьдрах чадвартай хэвээр үлдэнэ. Халдвар нь бохирдсон ундны ус болон амралтын усаар дамжин халдварладаг.
Хүмүүсийн ойр дотно харилцаа нь халдвар дамжих гол замуудын нэг юм (амаар-баасаар халдварлах зам). Шинж тэмдэггүй тээгч, өөрөөр хэлбэл өвчний эмнэлзүйн шинж тэмдэг илэрдэггүй боловч бусад хүмүүст халдварлах чадвартай хүмүүс бүртгэгдсэн.
Насанд хүрэгсдийн биеэс EHEC бактерийг цэвэрлэх хугацаа нэг долоо хоног ба түүнээс бага байдаг. Хүүхдэд энэ хугацаа илүү урт байж болно. Эрсдлийн чухал хүчин зүйлүүд нь малтай шууд харьцах боломжтой фермүүд болон бусад газруудад зочлох явдал юм.
Хяналт, урьдчилан сэргийлэх арга
Халдвараас урьдчилан сэргийлэхийн тулд хүнсний гинжин хэлхээний бүх үе шатанд хяналтын арга хэмжээг дагаж мөрдөх ёстой - ферм дэх хөдөө аж ахуйн үйлдвэрлэлээс эхлээд худалдааны байгууллага болон гэртээ хоол боловсруулах, боловсруулах, бэлтгэх хүртэл.
Эрүүл мэндийн албаныхан удаж байна Антибиотикийн хэт хэрэглээг таслан зогсоох цаг болжээ, энэ нь E. coli халдварын хэвийн бус омгийн эсэргүүцлийг нэмэгдүүлэхэд хүргэдэг.Европт E. coli O104 халдварын томоохон дэгдэлт 1800 гаруй хүнд халдварлаж, 500 гаруй хүнд цус задралын уремийн хам шинж гэгддэг үхэлд хүргэж болзошгүй хүндрэлийг үүсгээд байна.
Дэгдэлт дор хаяж 13 улсын хилийг давж, 20 орчим хүн нас баржээ.
Эрүүл мэндийн эрх баригчид хүнсний бүтээгдэхүүний дэгдэлтийг тодорхойлохоор тэмцэж байх үед олон улсын анхаарал дэлхийн худалдааны эрин үед хөдөө аж ахуйн бүтээгдэхүүн дагаж мөрддөг нарийн төвөгтэй замнал дээр төвлөрч байна.
Эпидемийн нэг тал дээр бага анхаарал хандуулсан: Энэ хэвийн бус омог нь олон төрлийн антибиотикт тэсвэртэй байдаг.
Өвчний дэгдэлтээс үүдэлтэй тулгамдсан бүх асуултын дунд энэхүү хурцадмал байдал нь бүх хонхыг цохиж, өвчний асуудлыг нухацтай авч үзэхийг уриалж байна. антибиотикийн хэт их хэрэглээг хязгаарлаххалдвараас үүдэлтэй.
O104 омгийн эсэргүүцлийн талаар дурьдсан боловч асуудал гэхээсээ илүү энэ халдварыг ялгаж буй сониуч байдлын үүднээс авч үзсэн.
E. coli халдварыг эмчлэх хамгийн найдвартай арга бол энэ нь чухал юм мөн хорт бодис үүсгэдэг, E. coli шиг.
Антибиотик хэрэглэхээс татгалзах шаардлагатайУчир нь эм нь нянг устгахдаа хорт бодис үүсгэдэг бөгөөд энэ нь өвчний шинж тэмдгийг улам дордуулдаг.
Тиймээс антибиотикийг E. coli-ийн халдварын эсрэг хэрэглэх боломжгүй тул тэдгээр нь ажиллах эсэх нь эрдэм шинжилгээний сонирхлын сэдэв болсон бөгөөд энэ нь дэлхий даяар хурдан шинжилгээ хийж буй сайн дурын судлаачдын онлайнаар хэлэлцсэн олон асуудлын нэг юм.
Хэдийгээр энэ нь одоогийн хохирогчдод хамааралгүй байсан ч энэ нь E. coli халдварын антибиотикт тэсвэртэй байдлыг тэмдэглэх нь зүйтэй.
Зарим талаараа учир нь O104:H4 гэх мэт гэдэсний омгууд болон түүний илүү сайн мэддэг эгч O157:H7 омгуудаар үүсгэгддэг Шига токсин нь тэсвэрлэх чадвар ховор байдаг.
Наад зах нь энэ шалтгааны улмаас энэ аймшигт дайснаас хамгаалах шинэ аргуудыг боловсруулах шаардлагатай байна.
Хамгийн гол нь Европт дор хаяж арван жилийн турш O104 омгийн эсэргүүцлийг нэмэгдүүлдэг шинэ эсэргүүцлийн хүчин зүйлүүд бий болсон.
Тэдний омог руу шилжих нь эсэргүүцлийн хүчин зүйлүүд гарч ирсний дараа организмуудын хооронд тодорхойгүй, эмх замбараагүй хөдөлж болохыг харуулж байна.
Өдөр тутмын анагаах ухаан, хөдөө аж ахуйн фермд антибиотикийн зохисгүй хэрэглээг таслан зогсоох замаар антибиотик эсэргүүцлийн хөгжлийг удаашруулах нь хичнээн чухал болохыг онцлон тэмдэглэх нь зүйтэй.
Германы Роберт Кох хүрээлэнгийн мэдээлснээр, O104 омог нь арав гаруй антибиотикт тэсвэртэйнайман анги:
пенициллин
стрептомицин
тетрациклин
хинолон (налидиксины хүчил)
триметоприм/сульфаметоксазол
Цефалоспорины гурван үе
амоксил/клавулан хүчил
пиперациллин / сульбактам
пиперациллин/тазобактам.
Ийм олон тооны эмэнд тэсвэртэй байх нь O104 омог нь тэсвэртэй ESBL бактери агуулдаг болохыг харуулж байна.
Үнэн хэрэгтээ, Кох хүрээлэнгийн шинжилгээний дагуу омог нь энэ эсэргүүцлийг үүсгэдэг TEM-1 ба CTX-M-15 гэсэн хоёр генийг агуулдаг.
1990-ээд онд тэсвэртэй ESBL бактери болон Klebsiella нянгийн омгууд Европ даяар тархсан эмнэлэгээс олддог ноцтой халдварыг үүсгэснээс хойш энэ өмч эмч нарыг зовоож байна.
Тэд анх эрчимт эмчилгээний тасагт байгаа өвчтөнүүдэд нөлөөлж байсан тул эдгээр омгууд дэлхий даяар нэг их түгшүүр төрүүлээгүй.
Гэвч 2001 онд эдгээр эсэргүүцлийн хүчин зүйлүүд өдөр тутмын амьдралд нэвтэрч, үймээн самууныг үүсгэсэн.
Бактерийн удамшлын хөдөлгөөний улмаас эсэргүүцлийн генүүд нь гэдэсний савханцар нянгийн зарим омог руу шилжиж, хоолонд төдийлөн орж, хорт бодис үүсгэдэггүй, харин ерөнхийдөө тархаж, шээсний замын халдварт өвчин болон бусад өвчин үүсгэдэг. бага зэргийн өвчин.
Гэнэт Бирмингем, Шропширийн эмнэлгүүдэд E. coli болон ESBL бактерийн томоохон дэгдэлт ажиглагдаж, эмнэлгүүдэд ажиллаж буй эмч нар бие биедээ өвчин тусдаг залуу эмэгтэйчүүдийн талаар мэдээлж эхлэв. шинэ эм хэрэглэснээс болж давтагдах давсагны халдварт өвчин тусдаг.
Энэ бол зүгээр нэг 2000-аад оны үзэгдэл биш.
2010 оны 3-р сард Хойд Стаффордширийн их сургуулийн эмнэлэгт ESBL болон Klebsiella бактерийн дэгдэлт гарч, өвчтөний үхэлд хүргэсэн.
Эдгээр эсэргүүцлийн хүчин зүйлүүд хаанаас гардаг вэ?
Эсэргүүцлийг хөгжүүлэх нь зайлшгүй биологийн процесс юм; Ийм байдлаар эдгээр бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг өөр нян үүсгэсэн эсвэл судалгааны лабораторид зохиомлоор үйлдвэрлэсэн эсэхээс үл хамааран нян нь үхлийн аюултай бүрэлдэхүүн хэсгүүдээс хамгаалагдсан байдаг.
Гэсэн хэдий ч антибиотикийг хэтрүүлэн хэрэглэх нь үйл явцыг хурдасгаж, үр дүнг урьдчилан таамаглах аргагүй болгодог.
Хэн нэгэн ханиад, чихний халдвар гэх мэт эмчилгээнд зориулагдаагүй өвчний улмаас антибиотик хэрэглэх үед ийм хэт их хэрэглээ үүсдэг.
Агро аж үйлдвэрийн цогцолборт шинээр гарч ирж буй вирүсийг хянах, судлахгүйгээр нэг тонн бүтээгдэхүүн тутамд бага тунгаар антибиотик нэмэхэд энэ нь илүү их тохиолддог.
Испани, АНУ-д хийсэн судалгаагаар хөдөө аж ахуй болон ESBL нян үүсэх хоёрын хоорондын холбоог харуулж байна: тэд супермаркет тахианы маханд тэсвэртэй нянг илрүүлжээ.
Судлаачид дэгдэлтийг үүсгэсэн хүнсний ногоог тодорхойлсон ч тэсвэртэй бактери нь бүтээгдэхүүнд хэрхэн орсныг хэзээ ч хэлж чадахгүй.
2006 онд АНУ-д шинэ бууцайг бохирдуулсан O157 гэдэсний халдварын дэгдэлт орон даяар гарсан.
Хэдийгээр судлаачид фермийн ойролцоох мал, зэрлэг гахайнаас ялгадас байна гэж сэжиглэж байсан ч халдварын шалтгааныг тогтоож чадаагүй байна.
Гэхдээ бид энэ дэгдэлтийн үед антибиотикт тэсвэртэй байдал яагаад үүсдэгийг аль хэдийн мэдэж байгаа бөгөөд нян нь генетикийн материалыг хөдөлгөх завхайрлыг харгалзан үзэхэд O104 омог нь ижил төрлийн нян агуулдаг тул бусад төрлийн халдварыг дамжуулж чаддаг тул тэсвэртэй гэдгийг бид мэднэ.
Засгийн газар болон эрүүл мэндийн байгууллагууд эмэнд тэсвэртэй байдлыг удаашруулахын тулд чадах бүхнээ хийх цаг болжээ. дэлхий даяар антибиотикийн хэт хэрэглээг таслан зогсоох.
Энэхүү шинэ бүтээл нь биотехнологитой холбоотой бөгөөд дисбактериоз болон ходоод гэдэсний замын бусад эмгэгээс урьдчилан сэргийлэх, эмчлэхэд ашигладаг симбионт бичил биетний амьд өсгөвөр дээр суурилсан бактерийн бэлдмэл болох пробиотик бэлдмэлийг үйлдвэрлэгчдийн үйлдвэрлэлд хамаарна. Колибактерин пробиотик эмийг үйлдвэрлэгч Escherichia coli M17 омгийг 150 мг хүртэл тунгаар колицин Е1 үйлдвэрлэх ген, ампициллиний эсэргүүцлийг тодорхойлох хүчин зүйлсийг агуулсан коньюгатив бус, хөдөлгөөнгүй p Colap плазмидтай хамт нэвтрүүлсэн. /л. Үүссэн омог нь канамицин эсэргүүцэх ген - неомицин npt-ийг нэгтгэх замаар fimH pili төрлийн 1-р наалдамхай генийг идэвхгүй болгосноор хүсээгүй наалдамхай фенотипгүй болно. E. coli омог M17 fim H::Kan/p Colap нь B-7448 дугаарын дор VKPM-д хадгалагдсан. Энэ нь гэдэснийхээс бусад нүхийг колоничлох чадвар багатай пробиотик бэлдмэлийг бий болгох боломжийг олгодог. Антагонист идэвхжил нэмэгдэж, антибиотик эмчилгээний үед оршин суудаг. Баригдсан омогт оруулсан шинж чанарууд нь популяцид тогтвортой хадгалагддаг. Энэ нь омог дээр суурилсан стандарт эмийг үйлдвэрлэхэд тусалдаг бөгөөд өвчтөн антибиотик эмчилгээг хавсаргахгүйгээр эмийг уухад плазмид ялгарахгүй байхыг баталгаажуулдаг. 4 өвчтэй, 1 таб.
Энэхүү шинэ бүтээл нь биотехнологитой холбоотой бөгөөд симбионт бичил биетний амьд өсгөвөр дээр суурилсан бактерийн бэлдмэл болох пробиотикийг олж авахад ашиглаж болох гэдэсний савханцарын сайжруулсан омгийг бий болгохтой холбоотой юм. Пробиотикууд (энэ бүлгийн эмийн бусад нэрс: хэвийн ургамал, эубиотик, микробиотик) нь гэдэсний дисбиозоос урьдчилан сэргийлэх, эмчлэх үр дүнтэй арга юм. Дисбактериоз гэдэг нь оппортунист бичил биетүүд, ялангуяа гэдэсний бүлгийн бактери (Enterobacteriaceae) хурдацтай хөгжиж, янз бүрийн өвдөлтийн илрэлүүд дагалддаг микробын төрөл зүйл, тоон харьцааны мэдэгдэхүйц өөрчлөлт юм. Дисбактериозын чухал шалтгаан нь антибиотик болон бусад нянгийн эсрэг эм хэрэглэх явдал юм [Красноголовец В.Н. "Антибиотик хэрэглэсний үр дүнд үүссэн гэдэсний дисбиозын эмнэлзүйн ач холбогдол". Номонд. "Гэдэсний өвчнөөс урьдчилан сэргийлэх, эмчлэхэд колибактериныг ашиглах, түүнийг үйлдвэрлэх технологи". М., 1967, х. 223 - 243]. Одоогийн байдлаар Орос улсад "Колибактерин" ба "Бификол" пробиотик бэлдмэлүүдийг мэддэг бөгөөд эдгээрийг Escherichia coli омгийн M17 үндсэн дээр гаргаж авдаг бөгөөд энэ нь үндсэндээ A. Nissle-ийн тусгаарлагдсан E. coli омгийн дериватив бөгөөд үүнийг олж авахад ашигладаг. "Мутафлор" эм (Герман) [Перец Л.Г. "Хуурай колибактерин. Гэдэсний өвчнийг оношлох, эмчлэх, урьдчилан сэргийлэх шинэ аргууд". Номонд. "РСФСР-ын Эрүүл мэндийн яамны Эрдмийн анагаах ухааны зөвлөлийн пленумын илтгэлийн тезисүүд." М., 1961, х. 52-54]. Гэсэн хэдий ч анхны омгоос ялгаатай нь E. coli M17 омог нь колицин В-ийг нэгтгэх чадвараа алдсан тул гэдэсний бактерийн эсрэг антагонист үйл ажиллагааг бууруулсан байна [Shemchuk L.F. "Колибактерины стандартчилал", хураангуй. Биологийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигч, М., 1983, х. 16]. E. coli омгийн M17 болон түүний өмнөх үеийн бас нэг сул тал бол гэдэсний омгийн хувьд ер бусын бөгөөд хүсээгүй өндөр наалдамхай Mn төрлийн 1 fimbriae фенотиптэй байдаг. Энэ фенотип нь ихэвчлэн шээсний замын халдвар, эмнэлгийн уушгины хатгалгааны үед макроорганизмаас тусгаарлагдсан омгуудад илэрдэг [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Колибактерин эм үүсгэгч омогт хэрэглэсэн зэрлэг E. coli тусгаарлагуудын наалдамхай фенотипийг өөрчлөх арга." Туршилтын биологи, анагаах ухааны эмхэтгэл, 1997, 124-р боть, No9, х. 334 - 338]. E. coli M17 омгийн сул тал нь антибиотикт мэдрэмтгий байдаг. Тиймээс үүн дээр суурилсан эм нь антибиотик хэрэглэх үед үр дүнтэй байж чадахгүй. Үүний зэрэгцээ антибиотик ба пробиотикийг нэгэн зэрэг хэрэглэх нь дисбиоз үүсэхээс сэргийлж, улмаар эмчилгээний арга хэмжээний үр нөлөөг нэмэгдүүлж, эмчилгээний хугацааг багасгадаг. Шинэ бүтээлийн зорилго нь E. coli M17-ийн дериватив болох E. coli омгийг бий болгоход оршдог бөгөөд энэ нь мэдэгдэж буй E. coli M17 омгийн дээр дурдсан сул талуудыг арилгадаг, тухайлбал: антагонист идэвхжил буурсан, хүсээгүй наалдамхай фенотип, мэдрэмтгий байдал. антибиотик. Техникийн үр дүн нь антагонист идэвхжил нэмэгдсэн, макроорганизмын анхдагч гэдэснийхээс бусад нүхийг колоничлох чадвар буурсан, пенициллиний антибиотикийн дунд зэргийн тунг тэсвэрлэх чадвартай омог бий болгох явдал юм. Энэ зорилгод генийн болон генийн инженерчлэлийн аргыг ашиглан колицин E1 үүсгэдэг, дунд зэргийн ампициллиний концентрацид (150 U/мл) тэсвэртэй, идэвхгүйжүүлсэн бодис агуулсан E. coli омог M17 fimH::kan/pColap-ийг бий болгох замаар биелдэг. fimbrial adhesin кодлогч fimH ген. E. coli омог M17 fimH::kan/pColap-ийг Бүх Оросын үйлдвэрлэлийн бичил биетний цуглуулгад B-7448 регистрийн дугаараар хадгалуулсан. Уг омгийн патентлагдсан загвар нь дараах заалтууд дээр үндэслэсэн болно. Escherichia coli омгийн M17 омгийн геном дахь наалдамхай ген fimH pili төрлийн 1-ийг идэвхгүй болгож, коньюгатив бус, хөдөлгөөнгүй pColap плазмид pColap-ийн Escherichia савханцар омгийн M17 омгийг нэвтрүүлсэн нь бид анх удаагаа харуулсан. колицин E1 ба ампициллиний эсэргүүцлийг тодорхойлох хүчин зүйлсийг 150 мг/л хүртэл тунгаар үйлдвэрлэх нь гэдэснийхээс бусад нүхийг колоничлох чадвар багатай, антибиотик эмчилгээний үед антагонист идэвхжил нэмэгдэж, оршин суудаг пробиотик бэлдмэлийг бий болгох боломжийг олгодог. . Патентлагдсан генийн инженерийн шийдлийн мөн чанарыг зургаар дүрсэлсэн бөгөөд үүнд:
Зураг дээр. Зураг 1-д 1-р төрлийн fimH pili adhesin генийн согогтой E. coli M17fimH::kan/pColap-ийн рекомбинант омгийг олж авах схемийг үзүүлэв.
Зураг дээр. 2 - pColap эрлийз плазмидын барилгын диаграмм,
Зураг дээр. Зураг 3-т баригдсан Escherichia coli омгийн M17 fimH::kan/pColap, наалдамхай үйл ажиллагааны судалгааны үр дүнг харуулав.
Зураг дээр. 4 - баригдсан Escherichia coli омгийн M17 fimH::kan/pColap-ийн тогтвортой байдлын судалгааны үр дүн. E. coli-ийн M17 fimH::kan/pColap омгийг олж авахдаа түүний хамгийн ойрын аналог болох E. coli омог M17-г эхлэл болгон ашигласан. E. coli M17 эсүүдэд хүсээгүй өндөр наалдамхай Mn фенотипийг үүсгэдэг фимбриал адгезиныг арилгахын тулд канамицин-неомицин эсэргүүцэх ген npt-ийг адгезиныг кодлодог хромосомын fimH генд нэгтгэсэн рекомбинант омгийг олж авсан. Энэ зорилгоор бид R6K плазмидын дериватив pCH103 плазмидыг ашигласан бөгөөд энэ нь пирээс хамааралтай хуулбарлах системтэй бөгөөд зөвхөн пир генийг агуулсан омогуудад хадгалагдах боломжтой бөгөөд энэ нь түүний хуулбарыг баталгаажуулдаг [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Колибактерин эм үүсгэгч омогт хэрэглэсэн зэрлэг E. coli тусгаарлагуудын наалдамхай фенотипийг өөрчлөх арга." Туршилтын биологи, анагаах ухааны эмхэтгэл, 1997, 124-р боть, No9, х. 334 - 338]. Плазмид pCH103 нь ампициллиний эсэргүүцлийн ген ба фим-кластер ген агуулсан хромосомын фрагментийг агуулдаг бөгөөд үүнд канамицин (неомицин) эсэргүүцлийн ген npt-ийг оруулснаар fimH генийн бүрэн бүтэн байдал эвдэрдэг. E. coli омог M17 болж хувирсны дараа эсэд хадгалагдах боломжгүй бөгөөд нэг кромосомын үр дүнд эсвэл давхар кромосомын үр дүнд хромосомд бүхэлдээ нэгдсэн үед канамицинд тэсвэртэй хувиргагчид үүсч болно. гаруй (Зураг 1). Хоёрдугаар ангиллын хувиргагчид ампициллинд мэдрэмтгий хэвээр байна. Тэдгээрийн дотроос E. coli M17fimH::kan (эсвэл M17 fimH::npt) гэж тодорхойлсон омгийг сонгосон. Судалгаагаар үүссэн омог дахь манноз мэдрэмтгий наалдац байхгүй болохыг баталсан, i.e. FimH - фенотип. E. coli омгийн M17-ийн антагонист идэвхийг нэмэгдүүлэх, мэдэгдэж буй аргуудыг ашиглан ColE1 плазмид дээр суурилсан ампициллинд тэсвэртэй болгох ["Methods of молекул генетик ба генетикийн инженерчлэл", 1990, Новосибирск, "Наука", Сибирийн салбар, х. 7-10, 39-44] эрлийз плазмид pColap бүтээгдсэн (Зураг 1). Өвчин үүсгэгч бус E. coli омгоос тусгаарлагдсан анхны ColE1 плазмидыг нарийвчлан судалсан. Энэ нь нэлээн нарийн хүрээтэй хост (голчлон E. coli омгууд) бөгөөд бактерийн эсэд тогтвортой хадгалагддаг. Түүний нуклеотидын бүрэн дараалал, бүх генетикийн элементүүдийн үүрэг, тэдгээрийн үйл ажиллагааны зохицуулалтыг мэддэг. Плазмид нь колицин Е1-ийн нийлэгжилтийг тодорхойлдог бөгөөд энэ нь холбогдох бактерийн эсүүдэд хортой нөлөө үзүүлдэг. ColE1 плазмидын сул тал нь коньюгатив плазмидуудыг ашиглан бусад эсүүд рүү дайчлах чадвар бөгөөд энэ нь түүний бүтцэд мафийн бүс байдагтай холбоотой юм. BspLu11.1 хязгаарлалтын эндонуклеазыг ашигласнаар энэ бүсийг бүрэн устгаж, плазмидын бусад генетикийн элементүүд бараг нөлөөлөөгүй. Дараа нь хязгаарлах эндонуклеаза BspH1-ийг ашиглан лактамазын синтезийг кодлодог b1a генийг агуулсан фрагментийг мэдэгдэж байгаа pUC19 вектороос таслан авч, моб бүсгүй ColE1 плазмидын фрагментээр холбосон. Үүний үр дүнд pColap плазмидыг олж авсан. Энэ плазмид нь коньюгатив биш бөгөөд хөдөлгөөнд ордоггүй тул бусад бактерийн эсүүдэд бараг шилжих боломжгүй юм. pUC19 вектор болон бусад плазмидуудаас ялгаатай нь pColap нь ампициллинийг өөрчилсөн E. coli омгийн эсрэг зөвхөн дунд зэргийн эсэргүүцлийг хангадаг (Хүснэгт 1). Лактамазын генийн илэрхийлэл ийм муудаж байгаа нь генийн промоторын бүс (Хилберт хайрцаг) ба 5" бүс дэх зөрчлийн улмаас ажиглагдаж байгаа бөгөөд энэ нь генийг бүтээх явцад генетикийн залилангийн үр дүнд үүссэн экспрессийн үр ашгийг нэмэгдүүлдэг. pColap рекомбинант плазмид pColap. pColap агуулсан омгийн өндөр концентрацитай антибиотикт мэдрэмтгий байх нь таатай хүчин зүйл гэж үзэх ёстой.Тиймээс ямар нэг шалтгаанаар өвчтөний гэдсэнд энэ плазмид агуулсан омог хүсээгүй, эсвэл ямар нэг онцгой үйл явдлын үр дүнд , плазмидыг өөр омог руу шилжүүлж, дараа нь түүнийг агуулсан бүх эсийг өндөр концентрацитай β-лактам антибиотик ашиглан биеэс зайлуулж болно.E. coli M17 fimH::kan омог pColap плазмид болон E. coli-тай хувиргасан. M17 fimH::kan/pColap омог авсан.Омог нь дараах шинж чанартай.Морфологи.Грам сөрөг, сул хөдөлгөөнтэй нимгэн саваа бөөрөнхий үзүүртэй 1.5 - 2 микрон урттай.Соёл физиологийн онцлог. Махны пептон агар ба Хотингер агарын шөл. 37 хэмд 36 цаг ургасны дараа 1.5 - 2.5 мм диаметртэй дугуй цагаан тунгалаг колони үүсгэдэг, колонийн гадаргуу нь гөлгөр, ирмэг нь жигд, бүтэц нь нэгэн төрлийн, тууштай байдал нь зуурмаг, тэдгээр нь амархан эмульс болдог. Агар глюкоз (0.2%) бүхий хамгийн бага орчин M9. 40 цаг ургасны дараа 1-2 мм диаметртэй, саарал цагаан, тунгалаг, дугуй, гүдгэр, гөлгөр ирмэгтэй колони үүсгэдэг. Мах-пептон шөл, Хотингер шөл. 37 хэмд 18-24 цагийн дараа ургасны дараа хүчтэй жигд булингар, бага зэрэг тунадас, өвөрмөц үнэр ажиглагддаг. Глюкоз (0.2%) бүхий шингэн хамгийн бага орчин M9. Агааржуулалттай ургаж 20-24 цагийн дараа хүчтэй жигд булингартай, үнэр нь сул эсвэл байхгүй болно. Мах-пептон агар дахь тарилгын аргаар ургах. Бүх тарилгын туршид сайн өсөлттэй. Бичил биетэн нь факультатив агааргүй амьтан юм. Хүрээлэн буй орчны температур ба рН-ийн хамаарал. 30-аас 42 хэм хүртэл, рН 6.8 - 7.2 температурт сайн ургадаг. Биохимийн шинж чанар. Глюкоз, сахароз, лактоз, фруктоз, манноз, ксилоз, маннитол, сорбитолыг хүчил, хий үүсгэх замаар сайн шингээдэг. рамноз, галактоз ба арабиноз - сул хүчил үүсэх; салицин - хойшлуулсан хүчил ба хий үүсэх; raffinose - зөвхөн хүчил үүсэх үед. Инозитол шингэдэггүй. Устөрөгчийн сульфид үүсгэдэггүй; индол үүсгэдэг. Антибиотикт хандах хандлага. 150 мг/л хүртэл орчинд ампициллинд тэсвэртэй. Бактероцины үйлдвэрлэл. Колицин Е1 үүсгэдэг. Плазмидын агууламж. Эсүүд нь ампициллинд тэсвэртэй, колицин Е1-ийн нийлэгжилтийг тодорхойлдог олон хуулбарт коньюгатив, хөдөлгөөнгүй плазмид pColap (5239 bp) агуулдаг. Уг омог нь O2:L1:H6 эсрэгтөрөгчийн томьёотой бөгөөд ийлдсийн титр 1:64000-аас багагүй байх үед ийлдсээр наалддаг. Шинэ бүтээлийг янз бүрийн плазмидуудыг зөөвөрлөх омгийн ампициллинд тэсвэртэй байдал, тариалалтын явцад тэдгээрийн шинж чанарын тогтвортой байдлыг тодорхойлдог жишээнүүдийн дагуу харуулсан болно. Жишээ 1. Ампициллиний янз бүрийн концентрацитай орчинд E. coli омгийн M17 болон түүний плазмид агуулсан деривативуудын өсөлтийн судалгаа (Хүснэгт 1). Судалгаанд хамрагдсан E. coli омог (Хүснэгт 1) Луриа шөлөнд (LB - 10 г триптон, 5 г мөөгөнцрийн ханд, 1 литр нэрмэл усанд 5 г NaCl) 37 oС-т агааржуулалттай 18 цагийн турш ургуулсан. Дараа нь бактерийн өсгөвөрийн цуваа шингэрүүлэлтийг физиологийн уусмалд 10-7 хүртэл бэлтгэж өсгөвөр бүрийг ампициллин агуулсан LA (LB + 1.6% агар) бүхий хавтан дээр 5, 50, 75, 100 концентрацитай (мкг/мл) тарьсан. , 125, 150, 200, 250. Колонийн өсөлтийг 18-24 цагийн дараа үнэлэв.Үр дүнг 1-р хүснэгтэд үзүүлэв.Хүснэгт 1-ээс харахад Escherichia coli M17-ийн анхны омог ампициллинд өндөр мэдрэмжтэй байгааг харуулж байна. Бидний бүтээсэн pColap плазмидын лактамаза генийн эх үүсвэр болсон M17/pUC19 омогт агуулагдах pUC19 плазмид нь ампициллиний 2 г/л хүртэлх концентрацид бактерийн эсийн эсэргүүцлийг өгдөг. Үүний зэрэгцээ M17 fimH::kan/pColap омогт агуулагдах pColap плазмид нь 150 мг/л-ээс ихгүй ампициллиний концентрацийг тэсвэрлэдэг. Иймээс үүссэн омгууд нь ампициллинд тэсвэртэй дунд зэрэгтэй байдаг. Жишээ 2. Наалдамхай шинж чанарыг судлах, Е омгийн наалдамхай фенотипийг тодорхойлох. coli M17 ба түүний деривативууд. Наалдамхай фенотипийг стандарт "өсөлтийг судлах" аргаар тодорхойлсон. Судалгаанд хамрагдсан бактерийн омгийн шинэ өсгөвөрөөс бактерийн эсийн суспензийг 540 нм долгионы урттай 1.0 оптик нягттай физиологийн уусмалд бэлтгэсэн. Үүний зэрэгцээ худагт хөдөлгөөнгүй наалдсан субстратуудыг MN (мөөгөнцрийн маннан), RN (үхрийн RNase B) болон BSA (үхрийн ийлдэс альбумин) агуулсан хавтгай ёроолтой микротитр хавтанг бэлтгэсэн. Дараа нь бактерийн суспензийг нүхэнд хийж 40 минутын турш өсгөвөрлөнө. Холбоогүй бактерийн эсийг давсны уусмалаар сайтар угаана. Цооногуудад тэжээллэг бодис нэмж, 37 хэмд 2.5-3 цагийн турш байнгын хутгах замаар нүхэнд булингар үүсэх хүртэл өсгөвөрлөнө. Худаг тус бүрийн оптик нягтыг автомат микроплит уншигч (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, Calif., USA) ашиглан бүртгэсэн. Энэ туршилтаар E. coli-ийн дараах омог судалсан: M17 - анхны омог; M17 fimH::kan - идэвхгүйжүүлсэн fimH наалдамхай гентэй M17 омог: M17 fimH: : kan/pPKL91 - fimB зохицуулалтын генийг агуулсан pPKL91 плазмидаар хувиргасан омог, үүнд бактерийн эсээр 1-р төрлийн пилигийн илэрхийлэл орно. ; M17fimH::kan/pColap омог - бидний бүтээсэн pColap плазмидын тусламжтайгаар хувиргасан M17 fimH::kan омог нь ампициллинд тэсвэртэй байдал болон колицин Е1 нийлэгжилтийг тодорхойлдог. E. coli M17 омгийн наалдамхай идэвхжил ба E. coli M17 омгийн деривативын "өсөлтийн судалгаа" -ын аргаар үнэлэгдсэн судалгааны үр дүнг Зураг дээр үзүүлэв. 3 (ординат нь 540 нм долгионы урттай оптик нягтын утгыг харуулж байна; абсцисса нь судлагдсан E. coli омог харуулж байна: 1 - M17; 2 - M17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - M17 fimH ::kan/pColap). Зураг дээрээс харж болно. 3-т, E. coli M17-ийн анхны омог нь RNase B ба маннантай сайн холбогддог нь MN наалдамхай фенотипийг харуулж байгаа бөгөөд гэдэсний савханцар омгийн хувьд хүсээгүй. Бидний олж авсан рекомбинант омог M17 fimH::kan нь дангаараа болон 1-р төрлийн пилигийн илэрхийлэл агуулсан плазмидыг оруулсны дараа наалдамхай идэвхгүй байдлыг харуулдаг. pColap плазмидыг (M17 fimH::kan/pColap омог) нэвтрүүлсний дараа ч энэ омогт наалдамхай идэвхжил байхгүй хэвээр байна. Жишээ 3. Плазмид pColap-аар тодорхойлогддог Escherichia coli омгийн M17 fimH::kan/pColap-ийн шинж чанаруудын тогтвортой байдлын судалгаа. Бидний бүтээсэн pColap плазмид нь колицин Е1 нийлэгжилтийг ба ампициллинд тэсвэртэй болгодог. Эдгээр шинж чанаруудыг хадгалах нь бактерийн эс дэх плазмидын хадгалалтын тогтвортой байдлаас хамаарна: плазмидын алдагдал нь холбогдох шинж чанараа алддаг. Ампициллинд тэсвэртэй байх тогтвортой байдал, үүссэн омгийн колициноген чанарыг 100 үеийн турш сонгомол бодисгүй шингэн тэжээлт орчинд тариалах үед тодорхойлсон. Эерэг хяналт болгон анхны плазмидыг ColE1, сөрөг хяналт болгон плазмидын тогтвортой байдалд нөлөөлдөг cer locus агуулаагүй ColE1 дериватив pBR322 плазмидыг ашигласан. M17 fimH::kan/pColap, M17/CoolE1 ба M17/pBR322 омгийн өсгөвөрийг ампициллин (100 мкг/мл) бүхий LB-д 37°С-т агааржуулж 18 цагийн турш ургуулсан. M17/CoolE1 омог ижил нөхцөлд ургуулсан боловч ампициллингүй. Үүссэн өсгөвөрт нэг мл тутамд 10 орчим бактерийн эс агуулагдаж байна. Дараа нь 10 мл (антибиотик нэмэлгүйгээр) 10 мкл (10 6) бактерийн өсгөврийг 10 мл LB бүхий хуруу шилэнд хийнэ. Үүссэн суспензийг дээр дурдсанчлан ургуулсан. Энэхүү тариалалтаар бактерийн эсүүд 10 хуваагдаж чадсан. Энэ үйлдлийг 10 удаа давтан хийснээр сонгомол бодисгүй орчинд анх тарьснаас хойш 100 үе дамжсан нянгийн өсгөвөр авсан. Тарилга бүрийн өмнө бактерийн өсгөвөрийн дээж авч, ампициллинд тэсвэртэй, колицин үүсэх эсэхийг шалгасан. Үүнийг хийхийн тулд бие даасан колони авах хүртэл эсийн суспензийг LA аяганд түрхэв. Дараа нь омог тус бүрийн 100 колони нь ампициллин (100 мкг/мл) байгаа нөхцөлд ижил орчинд ургах чадварыг шалгасан. Үүнээс гадна колони нь колицин Е1 үйлдвэрлэх чадварыг шалгасан. Энэ зорилгоор дээд агарын түрхлэг бүхий туршилтыг ашигласан (Миллер Ж. "Молекул генетикийн туршилт", М., "Мир", 1976, хуудас 183-189). Туршилт нь дараах байдалтай байна: туршилтын колониудыг репликатор эсвэл шүдний оо ашиглан 1.6% агар агуулсан хатуу тэжээллэг орчин бүхий ялтсууд дээр хатгана. Аяга тавгийг 37 хэмд 3-4 цагийн турш өсгөвөрлөж, колицин үүсэхийг 4-5 секундын турш хэт ягаан туяагаар өдөөж, ижил нөхцөлд шөнийн турш өсгөвөрлөнө. Дараа нь эсийг хлороформын уураар тасалгааны температурт 30-40 минутын турш задалдаг. Дараагийн алхамд бүх хлороформ аяганаас ууршсан эсэхийг шалгах нь чухал юм. 3-р давхарга - 5 мл хагас шингэн (0.7%) агарын тестийн омгийн E. coli (колицин E1-д мэдрэмтгий) 10 7/мл бактерийн эс агуулсан агарын доод давхарга дээр. 37 хэмд шөнийн турш өсгөвөрлөнө. Судалгаанд хамрагдсан омгийн цэгүүдийн эргэн тойронд туршилтын өсгөвөрийн давхаргад клирингийн бүс байгаа эсэхийг тэмдэглэнэ. Баригдсан Escherichia coli омгийн M17/pColap-ийн тогтвортой байдлын судалгааны үр дүнг Зураг дээр үзүүлэв. 2 (ColE1 нь M17/ColE1 омог, pBR322 нь M17/pBR322 омог, pColap нь M17/pColap омогтой тохирч байна). Бактерийн эсэд плазмид байгаа нь түүний анхны шинж чанар (колициноген ба/эсвэл ампициллинд тэсвэртэй) хадгалагдан үлддэг. Туршилтын үр дүн (Зураг 2) нь церлокусгүй pBR322 плазмид нь антибиотикгүй орчинд ургах үед бактерийн популяциас хурдан устдаг бол бусад хоёр плазмид (анхны ColE1 ба рекомбинант pColap) байгааг харуулж байна. ) эдгээр нөхцөлд эсүүд тогтвортой удамшдаг. Энэ шинж чанар нь нэг талаас pColap агуулсан омог дээр үндэслэсэн стандарт эм үйлдвэрлэхэд тусалдаг, нөгөө талаас эмийг хэрэглэх үед үүнийг баталгаажуулдаг тул манай дизайны чухал давуу талуудын нэг юм. Антибиотик эмчилгээ хийлгээгүй өвчтөнд плазмид арилахгүй. Аж үйлдвэрийн хэрэглээ. Патентлагдсан Escherichia coli M17 rimH::kan/pColap омгийг бүтээх аргын өгөгдсөн тайлбар нь генийн инженерийн судалгаанд ашигладаг стандарт арга, урвалж, тоног төхөөрөмжийг ашиглан омгийг дахин олж авахад хангалттай.
Нэхэмжлэх
Escherichia coli бактерийн омог M 17 fim H::kan/p Colap VKPM B-7448, пробиотик бэлдмэлийг авахад ашигладаг.Энэхүү шинэ бүтээл нь биотехнологитой холбоотой бөгөөд дисбактериоз болон ходоод гэдэсний замын бусад эмгэгээс урьдчилан сэргийлэх, эмчлэхэд ашигладаг симбионт бичил биетний амьд өсгөвөр дээр суурилсан бактерийн бэлдмэл болох пробиотик бэлдмэлийг үйлдвэрлэгчдийн үйлдвэрлэлд хамаарна. Колибактерин пробиотик эмийг үйлдвэрлэгч Escherichia coli M17 омгийг 150 мг хүртэл тунгаар колицин Е1 үйлдвэрлэх ген, ампициллиний эсэргүүцлийг тодорхойлох хүчин зүйлсийг агуулсан коньюгатив бус, хөдөлгөөнгүй p Colap плазмидтай хамт нэвтрүүлсэн. /л. Үүссэн омог нь канамицин эсэргүүцэх ген - неомицин npt-ийг нэгтгэх замаар fimH pili төрлийн 1-р наалдамхай генийг идэвхгүй болгосноор хүсээгүй наалдамхай фенотипгүй болно. E. coli омог M17 fim H::Kan/p Colap нь B-7448 дугаарын дор VKPM-д хадгалагдсан. Энэ нь гэдэснийхээс бусад нүхийг колоничлох чадвар багатай пробиотик бэлдмэлийг бий болгох боломжийг олгодог. Антагонист идэвхжил нэмэгдэж, антибиотик эмчилгээний үед оршин суудаг. Баригдсан омогт оруулсан шинж чанарууд нь популяцид тогтвортой хадгалагддаг. Энэ нь омог дээр суурилсан стандарт эмийг үйлдвэрлэхэд тусалдаг бөгөөд өвчтөн антибиотик эмчилгээг хавсаргахгүйгээр эмийг уухад плазмид ялгарахгүй байхыг баталгаажуулдаг. 4 өвчтэй, 1 таб.
Энэхүү шинэ бүтээл нь биотехнологитой холбоотой бөгөөд симбионт бичил биетний амьд өсгөвөр дээр суурилсан бактерийн бэлдмэл болох пробиотикийг олж авахад ашиглаж болох гэдэсний савханцарын сайжруулсан омгийг бий болгохтой холбоотой юм. Пробиотикууд (энэ бүлгийн эмийн бусад нэрс: хэвийн ургамал, эубиотик, микробиотик) нь гэдэсний дисбиозоос урьдчилан сэргийлэх, эмчлэх үр дүнтэй арга юм. Дисбактериоз гэдэг нь оппортунист бичил биетүүд, ялангуяа гэдэсний бүлгийн бактери (Enterobacteriaceae) хурдацтай хөгжиж, янз бүрийн өвдөлтийн илрэлүүд дагалддаг микробын төрөл зүйл, тоон харьцааны мэдэгдэхүйц өөрчлөлт юм. Дисбактериозын чухал шалтгаан нь антибиотик болон бусад нянгийн эсрэг эм хэрэглэх явдал юм [Красноголовец В.Н. "Антибиотик хэрэглэсний үр дүнд үүссэн гэдэсний дисбиозын эмнэлзүйн ач холбогдол". Номонд. "Гэдэсний өвчнөөс урьдчилан сэргийлэх, эмчлэхэд колибактериныг ашиглах, түүнийг үйлдвэрлэх технологи". М., 1967, х. 223 - 243]. Одоогийн байдлаар Орос улсад "Колибактерин" ба "Бификол" пробиотик бэлдмэлүүдийг мэддэг бөгөөд эдгээрийг Escherichia coli омгийн M17 үндсэн дээр гаргаж авдаг бөгөөд энэ нь үндсэндээ A. Nissle-ийн тусгаарлагдсан E. coli омгийн дериватив бөгөөд үүнийг олж авахад ашигладаг. "Мутафлор" эм (Герман) [Перец Л.Г. "Хуурай колибактерин. Гэдэсний өвчнийг оношлох, эмчлэх, урьдчилан сэргийлэх шинэ аргууд". Номонд. "РСФСР-ын Эрүүл мэндийн яамны Эрдмийн анагаах ухааны зөвлөлийн пленумын илтгэлийн тезисүүд." М., 1961, х. 52-54]. Гэсэн хэдий ч анхны омгоос ялгаатай нь E. coli M17 омог нь колицин В-ийг нэгтгэх чадвараа алдсан тул гэдэсний бактерийн эсрэг антагонист үйл ажиллагааг бууруулсан байна [Shemchuk L.F. "Колибактерины стандартчилал", хураангуй. Биологийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигч, М., 1983, х. 16]. E. coli омгийн M17 болон түүний өмнөх үеийн бас нэг сул тал бол гэдэсний омгийн хувьд ер бусын бөгөөд хүсээгүй өндөр наалдамхай Mn төрлийн 1 fimbriae фенотиптэй байдаг. Энэ фенотип нь ихэвчлэн шээсний замын халдвар, эмнэлгийн уушгины хатгалгааны үед макроорганизмаас тусгаарлагдсан омгуудад илэрдэг [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Колибактерин эм үүсгэгч омогт хэрэглэсэн зэрлэг E. coli тусгаарлагуудын наалдамхай фенотипийг өөрчлөх арга." Туршилтын биологи, анагаах ухааны эмхэтгэл, 1997, 124-р боть, No9, х. 334 - 338]. E. coli M17 омгийн сул тал нь антибиотикт мэдрэмтгий байдаг. Тиймээс үүн дээр суурилсан эм нь антибиотик хэрэглэх үед үр дүнтэй байж чадахгүй. Үүний зэрэгцээ антибиотик ба пробиотикийг нэгэн зэрэг хэрэглэх нь дисбиоз үүсэхээс сэргийлж, улмаар эмчилгээний арга хэмжээний үр нөлөөг нэмэгдүүлж, эмчилгээний хугацааг багасгадаг. Шинэ бүтээлийн зорилго нь E. coli M17-ийн дериватив болох E. coli омгийг бий болгоход оршдог бөгөөд энэ нь мэдэгдэж буй E. coli M17 омгийн дээр дурдсан сул талуудыг арилгадаг, тухайлбал: антагонист идэвхжил буурсан, хүсээгүй наалдамхай фенотип, мэдрэмтгий байдал. антибиотик. Техникийн үр дүн нь антагонист идэвхжил нэмэгдсэн, макроорганизмын анхдагч гэдэснийхээс бусад нүхийг колоничлох чадвар буурсан, пенициллиний антибиотикийн дунд зэргийн тунг тэсвэрлэх чадвартай омог бий болгох явдал юм. Энэ зорилгод генийн болон генийн инженерчлэлийн аргыг ашиглан колицин E1 үүсгэдэг, дунд зэргийн ампициллиний концентрацид (150 U/мл) тэсвэртэй, идэвхгүйжүүлсэн бодис агуулсан E. coli омог M17 fimH::kan/pColap-ийг бий болгох замаар биелдэг. fimbrial adhesin кодлогч fimH ген. E. coli омог M17 fimH::kan/pColap-ийг Бүх Оросын үйлдвэрлэлийн бичил биетний цуглуулгад B-7448 регистрийн дугаараар хадгалуулсан. Уг омгийн патентлагдсан загвар нь дараах заалтууд дээр үндэслэсэн болно. Escherichia coli омгийн M17 омгийн геном дахь наалдамхай ген fimH pili төрлийн 1-ийг идэвхгүй болгож, коньюгатив бус, хөдөлгөөнгүй pColap плазмид pColap-ийн Escherichia савханцар омгийн M17 омгийг нэвтрүүлсэн нь бид анх удаагаа харуулсан. колицин E1 ба ампициллиний эсэргүүцлийг тодорхойлох хүчин зүйлсийг 150 мг/л хүртэл тунгаар үйлдвэрлэх нь гэдэснийхээс бусад нүхийг колоничлох чадвар багатай, антибиотик эмчилгээний үед антагонист идэвхжил нэмэгдэж, оршин суудаг пробиотик бэлдмэлийг бий болгох боломжийг олгодог. . Патентлагдсан генийн инженерийн шийдлийн мөн чанарыг зургаар дүрсэлсэн бөгөөд үүнд: Зураг. Зураг 1-д 1-р төрлийн fimH pili adhesin генийн согогтой E. coli M17fimH::kan/pColap-ийн рекомбинант омгийг олж авах схемийг үзүүлэв. 2 - эрлийз плазмидын барилгын диаграмм pColap, Зураг. Зураг 3-т баригдсан Escherichia coli омгийн M17 fimH::kan/pColap-ийн наалдамхай үйл ажиллагааны судалгааны үр дүнг харуулав. 4 - баригдсан Escherichia coli омгийн M17 fimH::kan/pColap-ийн тогтвортой байдлын судалгааны үр дүн. E. coli-ийн M17 fimH::kan/pColap омгийг олж авахдаа түүний хамгийн ойрын аналог болох E. coli омог M17-г эхлэл болгон ашигласан. E. coli M17 эсүүдэд хүсээгүй өндөр наалдамхай Mn фенотипийг үүсгэдэг фимбриал адгезиныг арилгахын тулд канамицин-неомицин эсэргүүцэх ген npt-ийг адгезиныг кодлодог хромосомын fimH генд нэгтгэсэн рекомбинант омгийг олж авсан. Энэ зорилгоор бид R6K плазмидын дериватив pCH103 плазмидыг ашигласан бөгөөд энэ нь пирээс хамааралтай хуулбарлах системтэй бөгөөд зөвхөн пир генийг агуулсан омогуудад хадгалагдах боломжтой бөгөөд энэ нь түүний хуулбарыг баталгаажуулдаг [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Колибактерин эм үүсгэгч омогт хэрэглэсэн зэрлэг E. coli тусгаарлагуудын наалдамхай фенотипийг өөрчлөх арга." Туршилтын биологи, анагаах ухааны эмхэтгэл, 1997, 124-р боть, No9, х. 334 - 338]. Плазмид pCH103 нь ампициллиний эсэргүүцлийн ген ба фим-кластер ген агуулсан хромосомын фрагментийг агуулдаг бөгөөд үүнд канамицин (неомицин) эсэргүүцлийн ген npt-ийг оруулснаар fimH генийн бүрэн бүтэн байдал эвдэрдэг. E. coli омог M17 болж хувирсны дараа эсэд хадгалагдах боломжгүй бөгөөд нэг кромосомын үр дүнд эсвэл давхар кромосомын үр дүнд хромосомд бүхэлдээ нэгдсэн үед канамицинд тэсвэртэй хувиргагчид үүсч болно. гаруй (Зураг 1). Хоёрдугаар ангиллын хувиргагчид ампициллинд мэдрэмтгий хэвээр байна. Тэдгээрийн дотроос E. coli M17fimH::kan (эсвэл M17 fimH::npt) гэж тодорхойлсон омгийг сонгосон. Судалгаагаар үүссэн омог дахь манноз мэдрэмтгий наалдац байхгүй болохыг баталсан, i.e. FimH - фенотип. E. coli омгийн M17-ийн антагонист идэвхийг нэмэгдүүлэх, мэдэгдэж буй аргуудыг ашиглан ColE1 плазмид дээр суурилсан ампициллинд тэсвэртэй болгох ["Methods of молекул генетик ба генетикийн инженерчлэл", 1990, Новосибирск, "Наука", Сибирийн салбар, х. 7-10, 39-44] эрлийз плазмид pColap бүтээгдсэн (Зураг 1). Өвчин үүсгэгч бус E. coli омгоос тусгаарлагдсан анхны ColE1 плазмидыг нарийвчлан судалсан. Энэ нь нэлээн нарийн хүрээтэй хост (голчлон E. coli омгууд) бөгөөд бактерийн эсэд тогтвортой хадгалагддаг. Түүний нуклеотидын бүрэн дараалал, бүх генетикийн элементүүдийн үүрэг, тэдгээрийн үйл ажиллагааны зохицуулалтыг мэддэг. Плазмид нь колицин Е1-ийн нийлэгжилтийг тодорхойлдог бөгөөд энэ нь холбогдох бактерийн эсүүдэд хортой нөлөө үзүүлдэг. ColE1 плазмидын сул тал нь коньюгатив плазмидуудыг ашиглан бусад эсүүд рүү дайчлах чадвар бөгөөд энэ нь түүний бүтцэд мафийн бүс байдагтай холбоотой юм. BspLu11.1 хязгаарлалтын эндонуклеазыг ашигласнаар энэ бүсийг бүрэн устгаж, плазмидын бусад генетикийн элементүүд бараг нөлөөлөөгүй. Дараа нь хязгаарлах эндонуклеаза BspH1-ийг ашиглан лактамазын синтезийг кодлодог b1a генийг агуулсан фрагментийг мэдэгдэж байгаа pUC19 вектороос таслан авч, моб бүсгүй ColE1 плазмидын фрагментээр холбосон. Үүний үр дүнд pColap плазмидыг олж авсан. Энэ плазмид нь коньюгатив биш бөгөөд хөдөлгөөнд ордоггүй тул бусад бактерийн эсүүдэд бараг шилжих боломжгүй юм. pUC19 вектор болон бусад плазмидуудаас ялгаатай нь pColap нь ампициллинийг өөрчилсөн E. coli омгийн эсрэг зөвхөн дунд зэргийн эсэргүүцлийг хангадаг (Хүснэгт 1). Лактамазын генийн илэрхийлэл ийм муудаж байгаа нь генийн промоторын бүс (Хилберт хайрцаг) ба 5" бүс дэх зөрчлийн улмаас ажиглагдаж байгаа бөгөөд энэ нь генийг бүтээх явцад генетикийн залилангийн үр дүнд үүссэн экспрессийн үр ашгийг нэмэгдүүлдэг. pColap рекомбинант плазмид pColap. pColap агуулсан омгийн өндөр концентрацитай антибиотикт мэдрэмтгий байх нь таатай хүчин зүйл гэж үзэх ёстой.Тиймээс ямар нэг шалтгаанаар өвчтөний гэдсэнд энэ плазмид агуулсан омог хүсээгүй, эсвэл ямар нэг онцгой үйл явдлын үр дүнд , плазмидыг өөр омог руу шилжүүлж, дараа нь түүнийг агуулсан бүх эсийг өндөр концентрацитай β-лактам антибиотик ашиглан биеэс зайлуулж болно.E. coli M17 fimH::kan омог pColap плазмид болон E. coli-тай хувиргасан. M17 fimH::kan/pColap омог авсан.Омог нь дараах шинж чанартай.Морфологи.Грам сөрөг, сул хөдөлгөөнтэй нимгэн саваа бөөрөнхий үзүүртэй 1.5 - 2 микрон урттай.Соёл физиологийн онцлог. Махны пептон агар ба Хотингер агарын шөл. 37 хэмд 36 цаг ургасны дараа 1.5 - 2.5 мм диаметртэй дугуй цагаан тунгалаг колони үүсгэдэг, колонийн гадаргуу нь гөлгөр, ирмэг нь жигд, бүтэц нь нэгэн төрлийн, тууштай байдал нь зуурмаг, тэдгээр нь амархан эмульс болдог. Агар глюкоз (0.2%) бүхий хамгийн бага орчин M9. 40 цаг ургасны дараа 1-2 мм диаметртэй, саарал цагаан, тунгалаг, дугуй, гүдгэр, гөлгөр ирмэгтэй колони үүсгэдэг. Мах-пептонтой шөл, Хотингер шөл. 37 хэмд 18-24 цагийн дараа ургасны дараа хүчтэй жигд булингар, бага зэрэг тунадас, өвөрмөц үнэр ажиглагддаг. Глюкоз (0.2%) бүхий шингэн хамгийн бага орчин M9. Агааржуулалттай ургаж 20-24 цагийн дараа хүчтэй жигд булингартай, үнэр нь сул эсвэл байхгүй болно. Мах-пептон агар дахь тарилгын аргаар ургах. Бүх тарилгын туршид сайн өсөлттэй. Бичил биетэн нь факультатив агааргүй амьтан юм. Хүрээлэн буй орчны температур ба рН-ийн хамаарал. 30-аас 42 хэм хүртэл, рН 6.8 - 7.2 температурт сайн ургадаг. Биохимийн шинж чанар. Глюкоз, сахароз, лактоз, фруктоз, манноз, ксилоз, маннитол, сорбитолыг хүчил, хий үүсгэх замаар сайн шингээдэг. рамноз, галактоз ба арабиноз - сул хүчил үүсэх; салицин - хойшлуулсан хүчил ба хий үүсэх; raffinose - зөвхөн хүчил үүсэх үед. Инозитол шингэдэггүй. Устөрөгчийн сульфид үүсгэдэггүй; индол үүсгэдэг. Антибиотикт хандах хандлага. 150 мг/л хүртэл орчинд ампициллинд тэсвэртэй. Бактероцины үйлдвэрлэл. Колицин Е1 үүсгэдэг. Плазмидын агууламж. Эсүүд нь ампициллинд тэсвэртэй, колицин Е1-ийн нийлэгжилтийг тодорхойлдог олон хуулбарт коньюгатив, хөдөлгөөнгүй плазмид pColap (5239 bp) агуулдаг. Уг омог нь O2:L1:H6 эсрэгтөрөгчийн томьёотой бөгөөд ийлдсийн титр 1:64000-аас багагүй байх үед ийлдсээр наалддаг. Шинэ бүтээлийг янз бүрийн плазмидуудыг зөөвөрлөх омгийн ампициллинд тэсвэртэй байдал, тариалалтын явцад тэдгээрийн шинж чанарын тогтвортой байдлыг тодорхойлдог жишээнүүдийн дагуу харуулсан болно. Жишээ 1. Ампициллиний янз бүрийн концентрацитай орчинд E. coli омгийн M17 болон түүний плазмид агуулсан деривативуудын өсөлтийн судалгаа (Хүснэгт 1). Судалгаанд хамрагдсан E. coli омог (Хүснэгт 1) Луриа шөлөнд (LB - 10 г триптон, 5 г мөөгөнцрийн ханд, 1 литр нэрмэл усанд 5 г NaCl) 37 oС-т агааржуулалттай 18 цагийн турш ургуулсан. Дараа нь бактерийн өсгөвөрийн цуваа шингэрүүлэлтийг физиологийн уусмалд 10-7 хүртэл бэлтгэж өсгөвөр бүрийг ампициллин агуулсан LA (LB + 1.6% агар) бүхий хавтан дээр 5, 50, 75, 100 концентрацитай (мкг/мл) тарьсан. , 125, 150, 200, 250. Колонийн өсөлтийг 18-24 цагийн дараа үнэлэв.Үр дүнг 1-р хүснэгтэд үзүүлэв.Хүснэгт 1-ээс харахад Escherichia coli M17-ийн анхны омог ампициллинд өндөр мэдрэмжтэй байгааг харуулж байна. Бидний бүтээсэн pColap плазмидын лактамаза генийн эх үүсвэр болсон M17/pUC19 омогт агуулагдах pUC19 плазмид нь ампициллиний 2 г/л хүртэлх концентрацид бактерийн эсийн эсэргүүцлийг өгдөг. Үүний зэрэгцээ M17 fimH::kan/pColap омогт агуулагдах pColap плазмид нь 150 мг/л-ээс ихгүй ампициллиний концентрацийг тэсвэрлэдэг. Иймээс үүссэн омгууд нь ампициллинд тэсвэртэй дунд зэрэгтэй байдаг. Жишээ 2. Наалдамхай шинж чанарыг судлах, E. coli омгийн M17 болон түүний деривативын наалдамхай фенотипийг тодорхойлох. Наалдамхай фенотипийг стандарт "өсөлтийг судлах" аргаар тодорхойлсон. Судалгаанд хамрагдсан бактерийн омгийн шинэ өсгөвөрөөс бактерийн эсийн суспензийг 540 нм долгионы урттай 1.0 оптик нягттай физиологийн уусмалд бэлтгэсэн. Үүний зэрэгцээ худагт хөдөлгөөнгүй наалдсан субстратуудыг MN (мөөгөнцрийн маннан), RN (үхрийн RNase B) болон BSA (үхрийн ийлдэс альбумин) агуулсан хавтгай ёроолтой микротитр хавтанг бэлтгэсэн. Дараа нь бактерийн суспензийг нүхэнд хийж 40 минутын турш өсгөвөрлөнө. Холбоогүй бактерийн эсийг давсны уусмалаар сайтар угаана. Цооногуудад тэжээллэг бодис нэмж, 37 хэмд 2.5-3 цагийн турш байнгын хутгах замаар нүхэнд булингар үүсэх хүртэл өсгөвөрлөнө. Худаг тус бүрийн оптик нягтыг автомат микроплит уншигч (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, Calif., USA) ашиглан бүртгэсэн. Энэ туршилтаар E. coli-ийн дараах омог судалсан: M17 - анхны омог; M17 fimH::kan - идэвхгүйжүүлсэн fimH наалдамхай гентэй M17 омог: M17 fimH: : kan/pPKL91 - fimB зохицуулалтын генийг агуулсан pPKL91 плазмидаар хувиргасан омог, үүнд бактерийн эсээр 1-р төрлийн пилигийн илэрхийлэл орно. ; M17fimH::kan/pColap омог - бидний бүтээсэн pColap плазмидын тусламжтайгаар хувиргасан M17 fimH::kan омог нь ампициллинд тэсвэртэй байдал болон колицин Е1 нийлэгжилтийг тодорхойлдог. E. coli M17 омгийн наалдамхай идэвхжил ба E. coli M17 омгийн деривативын "өсөлтийн судалгаа" -ын аргаар үнэлэгдсэн судалгааны үр дүнг Зураг дээр үзүүлэв. 3 (ординат нь 540 нм долгионы урттай оптик нягтын утгыг харуулж байна; абсцисса нь судлагдсан E. coli омог харуулж байна: 1 - M17; 2 - M17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - M17 fimH ::kan/pColap). Зураг дээрээс харж болно. 3-т, E. coli M17-ийн анхны омог нь RNase B ба маннантай сайн холбогддог нь MN наалдамхай фенотипийг харуулж байгаа бөгөөд гэдэсний савханцар омгийн хувьд хүсээгүй. Бидний олж авсан рекомбинант омог M17 fimH::kan нь дангаараа болон 1-р төрлийн пилигийн илэрхийлэл агуулсан плазмидыг оруулсны дараа наалдамхай идэвхгүй байдлыг харуулдаг. pColap плазмидыг (M17 fimH::kan/pColap омог) нэвтрүүлсний дараа ч энэ омогт наалдамхай идэвхжил байхгүй хэвээр байна. Жишээ 3. Плазмид pColap-аар тодорхойлогддог Escherichia coli омгийн M17 fimH::kan/pColap-ийн шинж чанаруудын тогтвортой байдлын судалгаа. Бидний бүтээсэн pColap плазмид нь колицин Е1 нийлэгжилтийг ба ампициллинд тэсвэртэй болгодог. Эдгээр шинж чанаруудыг хадгалах нь бактерийн эс дэх плазмидын хадгалалтын тогтвортой байдлаас хамаарна: плазмидын алдагдал нь холбогдох шинж чанараа алддаг. Ампициллинд тэсвэртэй байх тогтвортой байдал, үүссэн омгийн колициноген чанарыг 100 үеийн турш сонгомол бодисгүй шингэн тэжээлт орчинд тариалах үед тодорхойлсон. Эерэг хяналт болгон анхны плазмидыг ColE1, сөрөг хяналт болгон плазмидын тогтвортой байдалд нөлөөлдөг cer locus агуулаагүй ColE1 дериватив pBR322 плазмидыг ашигласан. M17 fimH::kan/pColap, M17/CoolE1 ба M17/pBR322 омгийн өсгөвөрийг ампициллин (100 мкг/мл) бүхий LB-д 37°С-т агааржуулж 18 цагийн турш ургуулсан. M17/CoolE1 омог ижил нөхцөлд ургуулсан боловч ампициллингүй. Үүссэн өсгөвөрт нэг мл тутамд 10 орчим бактерийн эс агуулагдаж байна. Дараа нь 10 мл (антибиотик нэмэлгүйгээр) 10 мкл (10 6) бактерийн өсгөврийг 10 мл LB бүхий хуруу шилэнд хийнэ. Үүссэн суспензийг дээр дурдсанчлан ургуулсан. Энэхүү тариалалтаар бактерийн эсүүд 10 хуваагдаж чадсан. Энэ үйлдлийг 10 удаа давтан хийснээр сонгомол бодисгүй орчинд анх тарьснаас хойш 100 үе дамжсан нянгийн өсгөвөр авсан. Тарилга бүрийн өмнө бактерийн өсгөвөрийн дээж авч, ампициллинд тэсвэртэй, колицин үүсэх эсэхийг шалгасан. Үүнийг хийхийн тулд бие даасан колони авах хүртэл эсийн суспензийг LA аяганд түрхэв. Дараа нь омог тус бүрийн 100 колони нь ампициллин (100 мкг/мл) байгаа нөхцөлд ижил орчинд ургах чадварыг шалгасан. Үүнээс гадна колони нь колицин Е1 үйлдвэрлэх чадварыг шалгасан. Энэ зорилгоор дээд агарын түрхлэг бүхий туршилтыг ашигласан (Миллер Ж. "Молекул генетикийн туршилт", М., "Мир", 1976, хуудас 183-189). Туршилт нь дараах байдалтай байна: туршилтын колониудыг репликатор эсвэл шүдний оо ашиглан 1.6% агар агуулсан хатуу тэжээллэг орчин бүхий ялтсууд дээр хатгана. Аяга тавгийг 37 хэмд 3-4 цагийн турш өсгөвөрлөж, колицин үүсэхийг 4-5 секундын турш хэт ягаан туяагаар өдөөж, ижил нөхцөлд шөнийн турш өсгөвөрлөнө. Дараа нь эсийг хлороформын уураар тасалгааны температурт 30-40 минутын турш задалдаг. Дараагийн алхамд бүх хлороформ аяганаас ууршсан эсэхийг шалгах нь чухал юм. 3-р давхарга - 5 мл хагас шингэн (0.7%) агарын тестийн омгийн E. coli (колицин E1-д мэдрэмтгий) 10 7/мл бактерийн эс агуулсан агарын доод давхарга дээр. 37 хэмд шөнийн турш өсгөвөрлөнө. Судалгаанд хамрагдсан омгийн цэгүүдийн эргэн тойронд туршилтын өсгөвөрийн давхаргад клирингийн бүс байгаа эсэхийг тэмдэглэнэ. Баригдсан Escherichia coli омгийн M17/pColap-ийн тогтвортой байдлын судалгааны үр дүнг Зураг дээр үзүүлэв. 2 (ColE1 нь M17/ColE1 омог, pBR322 нь M17/pBR322 омог, pColap нь M17/pColap омогтой тохирч байна). Бактерийн эсэд плазмид байгаа нь түүний анхны шинж чанар (колициноген ба/эсвэл ампициллинд тэсвэртэй) хадгалагдан үлддэг. Туршилтын үр дүн (Зураг 2) нь церлокусгүй pBR322 плазмид нь антибиотикгүй орчинд ургах үед бактерийн популяциас хурдан устдаг бол бусад хоёр плазмид (анхны ColE1 ба рекомбинант pColap) байгааг харуулж байна. ) эдгээр нөхцөлд эсүүд тогтвортой удамшдаг. Энэ шинж чанар нь нэг талаас pColap агуулсан омог дээр үндэслэсэн стандарт эм үйлдвэрлэхэд тусалдаг, нөгөө талаас эмийг хэрэглэх үед үүнийг баталгаажуулдаг тул манай дизайны чухал давуу талуудын нэг юм. Антибиотик эмчилгээ хийлгээгүй өвчтөнд плазмид арилахгүй. Аж үйлдвэрийн хэрэглээ. Патентлагдсан Escherichia coli M17 rimH::kan/pColap омгийг бүтээх аргын өгөгдсөн тайлбар нь генийн инженерийн судалгаанд ашигладаг стандарт арга, урвалж, тоног төхөөрөмжийг ашиглан омгийг дахин олж авахад хангалттай.
Нэхэмжлэл
Escherichia coli бактерийн омог M 17 fim H::kan/p Colap VKPM B-7448, пробиотик бэлдмэл авахад ашигладаг.
Үүнтэй төстэй патентууд:
Энэхүү шинэ бүтээл нь биотехнологи, ялангуяа генийн инженерчлэл, анагаах ухаан, ялангуяа эмнэлгийн вирус судлал, дархлаа судлалтай холбоотой бөгөөд Марбургийн цусархаг халууралтын дархлааны оношлогоо, Марбургийн вирусын эсрэгбие, генийн инженерчлэлийн вакциныг олж авахад ашиглаж болно. вирус
