Zastosowanie właściwości typów reakcji immunologicznych. Reakcje immunologiczne Katedra Mikrobiologii i Wirusologii FGBOU VO

1.1. REAKCJA Aglutynacji (RA)

REAKCJA Aglutynacji (RA)

Ze względu na swoją specyfikę, łatwość ustawienia i demonstracyjność reakcja aglutynacji stała się powszechna w praktyce mikrobiologicznej w diagnostyce wielu chorób zakaźnych.

Reakcja aglutynacji opiera się na specyfice oddziaływania przeciwciał (aglutynin) z całymi komórkami drobnoustrojów lub innymi komórkami (aglutynogenami). W wyniku tego oddziaływania powstają cząstki – aglomeraty, które wytrącają się (aglutynują) w postaci płatków.

W reakcji aglutynacji mogą brać udział zarówno żywe, jak i martwe bakterie, krętki, grzyby, pierwotniaki, riketsje, a także erytrocyty i inne komórki. Reakcja przebiega w dwóch fazach: pierwsza (niewidoczna) specyficzna, połączenie antygenu i przeciwciał, druga (widoczna) niespecyficzna, wiązanie antygenów, tj. tworzenie się aglutynacji.

Aglutynat powstaje, gdy jedno centrum aktywne dwuwartościowego przeciwciała łączy się z grupą determinującą antygen. Reakcja aglutynacji, jak każda reakcja serologiczna, zachodzi w obecności elektrolitów.

Zewnętrznie przejaw dodatniej reakcji aglutynacji jest dwojaki. U drobnoustrojów niewiciowych, które mają jedynie somatyczny antygen O, same komórki drobnoustrojów sklejają się bezpośrednio ze sobą. Taka aglutynacja nazywana jest drobnoziarnistą. Odbywa się w ciągu 18 22 godzin. w

Drobnoustroje wiciowe mają dwa antygeny, somatyczny antygen O i wiciowy antygen H. Jeśli komórki sklejają się z wiciami, tworzą się duże luźne płatki i taką reakcję aglutynacji nazywamy gruboziarnistą. Przychodzi w ciągu 2 4 godzin.

Reakcję aglutynacji można ustawić zarówno w celu jakościowego i ilościowego oznaczenia swoistych przeciwciał w surowicy krwi pacjenta, jak i w celu określenia gatunku wyizolowanego patogenu. w

Reakcję aglutynacji można ustawić zarówno w wersji szczegółowej, która pozwala na pracę z surowicą rozcieńczoną do miana diagnostycznego, jak i w wariancie ustawienia reakcji orientacyjnej, która pozwala w zasadzie na wykrycie specyficznych przeciwciał lub określenie gatunku przeciwciała. patogen.

Ustalając szczegółową reakcję aglutynacji, w celu wykrycia specyficznych przeciwciał w surowicy krwi pacjenta, pobiera się surowicę testową w rozcieńczeniu 1:50 lub 1:100. Wynika to z faktu, że w surowicy pełnej lub lekko rozcieńczonej prawidłowe przeciwciała mogą występować w bardzo dużych stężeniach, a wtedy wyniki reakcji mogą być niedokładne. Materiałem badawczym w tym wariancie reakcji jest krew pacjenta.

Krew pobiera się na czczo lub nie wcześniej niż 6 godzin po posiłku (w przeciwnym razie w surowicy krwi mogą znajdować się kropelki tłuszczu, przez co będzie ona mętna i nienadająca się do badań). Surowicę krwi pacjenta pobiera się zwykle w drugim tygodniu choroby, pobierając jałowo z żyły łokciowej 3–4 ml krwi (w tym czasie koncentruje się maksymalna ilość swoistych przeciwciał). Jako znany antygen stosuje się narzędzie diagnostyczne przygotowane z zabitych, ale nie zniszczonych komórek drobnoustrojów określonego gatunku o określonej strukturze antygenowej.

Przy ustalaniu szczegółowej reakcji aglutynacji w celu określenia gatunku, rodzaju patogenu, antygenem jest żywy patogen wyizolowany z materiału testowego. Znane są przeciwciała zawarte w surowicy diagnostycznej układu odpornościowego. w

Immunologiczną surowicę diagnostyczną uzyskuje się z krwi zaszczepionego królika. Po określeniu miana (maksymalnego rozcieńczenia, w którym wykryto przeciwciała) surowicę diagnostyczną rozlewa się do ampułek z dodatkiem środka konserwującego. Surowicę tę stosuje się do identyfikacji na podstawie struktury antygenowej wyizolowanego patogenu.

OPCJE REAKCJI NA Aglutynację

W reakcjach tych biorą udział antygeny w postaci cząstek (komórki drobnoustrojów, erytrocyty i inne antygeny korpuskularne), które sklejają się z przeciwciałami i wytrącają się.

Do wywołania reakcji aglutynacji (RA) potrzebne są trzy składniki: 1) antygen (aglutynogen); 2) przeciwciało (aglutynina) i 3) elektrolit (izotoniczny roztwór chlorku sodu).

WSKAZÓWKA (PŁYTKA) REAKCJA Aglutynacji (RA)

Przybliżony lub płytkowy RA umieszcza się na szkiełku w temperaturze pokojowej. W tym celu za pomocą pipety Pasteura nanosi się oddzielnie na szkło kroplę surowicy w rozcieńczeniu 1:10 1:20 i kroplę kontrolną izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do obu pętli bakteriologicznych wprowadza się kolonie lub codzienną hodowlę bakterii (kropla Diagnostyka) i dokładnie miesza. Reakcje ocenia się wizualnie w ciągu kilku minut, czasami za pomocą szkła powiększającego (x5). Przy dodatnim RA w kropli z surowicą odnotowuje się pojawienie się dużych i małych płatków, przy ujemnym, surowica pozostaje równomiernie mętna.

REAKCJA POŚREDNIEJ (PASYWNEJ) HEMAGLUTYNACJI (RNHA, RPHA)

Reakcja jest nastawiona na: 1) wykrywanie polisacharydów, białek, ekstraktów bakterii i innych silnie rozproszonych substancji, riketsj i wirusów, których kompleksów z aglutyninami nie widać w zwykłym RZS, lub 2) wykrywanie przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko tym silnie rozproszone substancje i najmniejsze mikroorganizmy.

Przez aglutynację pośrednią lub pasywną rozumie się reakcję, w której przeciwciała oddziałują z antygenami uprzednio zaadsorbowanymi na obojętnych cząstkach (lateks, celuloza, polistyren, tlenek baru itp. lub erytrocyty baranowe, I (0) grupy krwi ludzkiej).

W biernej reakcji hemaglutynacji (RPHA) jako nośnik wykorzystywane są erytrocyty. Erytrocyty obciążone antygenem sklejają się w obecności specyficznych przeciwciał przeciwko temu antygenowi i wytrącają się. Erytrocyty uwrażliwione na antygen są stosowane w RPGA jako narzędzie diagnostyczne erytrocytów do wykrywania przeciwciał (serodiagnoza). Jeżeli erytrocyty są obciążone przeciwciałami (erythrocyte antibody Diagnosticum), wówczas można je wykorzystać do wykrycia antygenów.

Inscenizacja. W dołkach tabletek styropianowych przygotować serię seryjnych rozcieńczeń surowicy. Do przedostatniego dołka dodaje się 0,5 ml znanej surowicy dodatniej, a do ostatniego dołka dodaje się 0,5 ml roztworu soli (kontrola). Następnie do wszystkich dołków dodaje się 0,1 ml rozcieńczonego erytrocytu diagnostycznego, wytrząsa i umieszcza w termostacie na 2 godziny.

Księgowość. W przypadku pozytywnym erytrocyty osiadają na dnie otworu w postaci równej warstwy komórek o złożonej lub postrzępionej krawędzi (odwrócony parasol), w przypadku negatywnym osiadają w postaci guzika lub pierścienia .

1.2. REAKCJA NEUTRALIZACJI. LIZA,
REAKCJA OPSONOFAGOCYTYCZNA, REAKCJA NADWRAŻLIWOŚCI

REAKCJA NEUTRALIZACJI EGZOTOKSYNY Z ANTYTOKSYNĄ (RN)

Reakcja opiera się na zdolności surowicy antytoksycznej do neutralizacji działania egzotoksyn. Służy do miareczkowania surowic antytoksycznych i oznaczania egzotoksyn.

Podczas miareczkowania surowicy do różnych rozcieńczeń surowicy antytoksycznej dodaje się pewną dawkę odpowiedniej toksyny. Przy całkowitej neutralizacji antygenu i braku niewykorzystanych przeciwciał następuje początkowa flokulacja. Reakcję flokulacji można zastosować nie tylko do miareczkowania surowicy (na przykład w przypadku błonicy), ale także do miareczkowania toksyny i toksoidu. Reakcja neutralizacji toksyny z antytoksyną ma duże znaczenie praktyczne jako metoda oznaczania aktywności antytoksycznych surowic terapeutycznych. Antygenem w tej reakcji jest prawdziwa egzotoksyna.

Siłę antytoksycznej surowicy określa się za pomocą konwencjonalnych jednostek AE.

1 AU surowicy botulinowej w tej ilości neutralizuje 1000 DLM toksyny botulinowej. Reakcję neutralizacji w celu określenia gatunku lub rodzaju egzotoksyny (w diagnostyce tężca, zatrucia jadem kiełbasianym, błonicy itp.) można przeprowadzić in vitro (według Ramona), a przy określaniu toksyczności komórek drobnoustrojów - w żelu ( według Ouchterlony’ego).

Reakcja lizy (RL)

Jedną z ochronnych właściwości surowicy odpornościowej jest jej zdolność do rozpuszczania drobnoustrojów lub elementów komórkowych, które dostają się do organizmu.

Specyficzne przeciwciała, które powodują rozpuszczanie (lizę) komórek, nazywane są lizynami. W zależności od charakteru antygenu mogą to być bakteriolizyny, cytolizyny, spirochetolizyny, hemolizyny itp.

Lizyny wykazują swoje działanie jedynie w obecności dodatkowego czynnika – dopełniacza. Dopełniacz, jako czynnik nieswoistej odporności humoralnej, występuje niemal we wszystkich płynach ustrojowych, z wyjątkiem płynu mózgowo-rdzeniowego i płynu przedniej komory oka. Dość wysoką i stałą zawartość dopełniacza stwierdzono w surowicy krwi ludzkiej, a dużą w surowicy krwi świnek morskich. U innych ssaków zawartość dopełniacza w surowicy krwi jest inna.

Dopełniacz to złożony układ białek serwatkowych. Jest niestabilny i zapada się w temperaturze 55 stopni przez 30 minut. W temperaturze pokojowej dopełniacz ulega zniszczeniu w ciągu dwóch godzin. Jest bardzo wrażliwy na długotrwałe wstrząsanie, działanie kwasów i promieni ultrafioletowych. Jednakże dopełniacz przechowuje się przez długi czas (do sześciu miesięcy) w stanie wysuszonym, w niskiej temperaturze. Dopełniacz wspomaga lizę komórek drobnoustrojów i erytrocytów.

Rozróżnij reakcję bakteriolizy i hemolizy.

Istota reakcji bakteriolizy polega na tym, że połączenie specyficznej surowicy odpornościowej z odpowiadającymi jej homologicznymi żywymi komórkami drobnoustrojów w obecności dopełniacza powoduje lizę drobnoustrojów.

Reakcja hemolizy polega na tym, że gdy erytrocyty zostaną poddane działaniu specyficznej, odpornej na nie surowicy (hemolitycznej) w obecności dopełniacza, erytrocyty rozpuszczają się, tj. hemoliza.

Reakcja hemolizy w praktyce laboratoryjnej służy do określenia rodzaju dopełniacza, a także do uwzględnienia wyników diagnostycznych testów wiązania dopełniacza. Miano dopełniacza to najmniejsza ilość powodująca lizę erytrocytów w ciągu 30 minut w układzie hemolitycznym w objętości 2,5 ml. Reakcja lizy, jak wszystkie reakcje serologiczne, zachodzi w obecności elektrolitu.

REAKCJE NADWRAŻLIWOŚCI (ALERGICZNE).

Pewne formy antygenu po wielokrotnym kontakcie z organizmem mogą wywołać reakcję zasadniczo specyficzną, ale obejmującą niespecyficzne czynniki komórkowe i molekularne ostrej odpowiedzi zapalnej. Znane są dwie formy nadwrażliwości: nadwrażliwość typu natychmiastowego (ITH) i nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH). Pierwszy rodzaj reakcji objawia się udziałem przeciwciał, natomiast reakcja rozwija się nie później niż 2 godziny po wielokrotnym kontakcie z alergenem. Drugi typ realizowany jest za pomocą zapalnych limfocytów T (Tr3) jako głównych efektorów reakcji, które zapewniają akumulację makrofagów w strefie zapalenia, reakcja objawia się po 6-8 godzinach i później.

Rozwój reakcji nadwrażliwości poprzedzony jest spotkaniem z antygenem i wystąpieniem uczulenia, tj. pojawienie się przeciwciał, aktywnie uczulonych limfocytów i pasywnie uczulonych przez cytofilowe przeciwciała innych leukocytów (makrofagi, granulocyty).

Reakcje nadwrażliwości mają trzy fazy rozwoju: immunologiczną; patochemiczny; patofizjologiczne.

W pierwszej, specyficznej fazie, alergen oddziałuje z przeciwciałami i (lub) uwrażliwionymi komórkami. W drugiej fazie z aktywowanych komórek uwalniane są substancje biologicznie czynne. Uwolnione mediatory (histamina, serotonina, leukotrieny, bradykinina itp.) powodują różne efekty obwodowe charakterystyczne dla odpowiedniego typu reakcji - trzeciej fazy.

Reakcje nadwrażliwości czwartego typu

Reakcje tego typu spowodowane są patogennymi interakcjami międzykomórkowymi uwrażliwionych Thelperów, cytotoksycznych limfocytów T (Tkillers) i aktywowanych komórek układu fagocytów jednojądrzastych, spowodowanych przedłużoną stymulacją układu odpornościowego przez antygeny bakteryjne, u których występuje względna niewydolność układu odpornościowego organizmu. system eliminacji patogenów bakteryjnych ze środowiska wewnętrznego chorób zakaźnych. Te reakcje nadwrażliwości powodują gruźlicze jamy płuc, ich martwicę serowatą i ogólne zatrucie u pacjentów z gruźlicą. Ziarniniakowatość skóry w gruźlicy i trądzie pod względem morfopatogenetycznym składa się w dużej mierze z reakcji nadwrażliwości czwartego typu.

Najbardziej znanym przykładem reakcji nadwrażliwości typu 4 jest reakcja Mantoux, która rozwija się w miejscu śródskórnego podania tuberkuliny pacjentowi, którego organizm i układ są uczulone na antygeny prątków. W wyniku reakcji tworzy się gęsta, przekrwiona grudka z martwicą w środku, która pojawia się dopiero po kilku godzinach (powoli) po śródskórnym podaniu tuberkuliny. Tworzenie grudki rozpoczyna się od wyjścia z łożyska naczyniowego do przestrzeni międzykomórkowych jednojądrzastych fagocytów krążącej krwi. Jednocześnie rozpoczyna się emigracja komórek wielojądrzastych z łożyska naczyniowego. Następnie naciek neutrofili ustępuje, a naciek zaczyna składać się głównie z limfocytów i fagocytów jednojądrzastych. Na tym polega różnica między reakcją Mantoux a reakcją Arthusa, w której w miejscu zmiany gromadzą się głównie leukocyty wielojądrzaste.

W reakcjach nadwrażliwości czwartego typu długotrwała stymulacja uczulonych limfocytów antygenami prowadzi do patologicznie intensywnego i przedłużonego uwalniania cytokin przez komórki pomocnicze T w miejscach zmian patologicznych w tkankach. Intensywne uwalnianie cytokin w loci uszkodzenia tkanki powoduje hiperaktywację komórek układu znajdujących się tam fagocytów jednojądrzastych, z których wiele tworzy pasma komórek nabłonkowych w stanie hiperaktywnym, a niektóre łączą się ze sobą, tworząc komórki olbrzymie. Makrofagi, na powierzchni których odsłonięte są antygeny bakteryjne i wirusowe, mogą zostać zniszczone poprzez działanie Tkillerów (naturalnych zabójców).

Reakcja nadwrażliwości czwartego typu jest wywoływana przez rozpoznanie obcego antygenu bakteryjnego przez uwrażliwione na niego komórki pomocnicze T. Warunkiem koniecznym rozpoznania jest oddziaływanie induktorów z antygenami eksponowanymi na powierzchni komórek prezentujących antygen po endocytozie i przetworzeniu obcych immunogenów przez fagocyty jednojądrzaste. Kolejnym niezbędnym warunkiem jest ekspozycja antygenów w połączeniu z cząsteczkami klasy I z głównego kompleksu zgodności tkankowej. Po rozpoznaniu antygenu uczulone substancje pomocnicze uwalniają cytokiny, a w szczególności interleukinę 2, która aktywuje naturalne czynniki zabójcze i fagocyty jednojądrzaste. Aktywowane fagocyty jednojądrzaste uwalniają enzymy proteolityczne i wolne rodniki tlenowe, które uszkadzają tkanki.

Testy skórnoalergiczne badania mające na celu ustalenie uczulenia organizmu na alergeny, określenie jego zakażenia np. gruźlicą, brucelozą, poziomu odporności stadnej np. na tularemię. W zależności od miejsca wprowadzenia alergenu wyróżnia się: 1) testy skórne; 2) wertykulacja; 3) śródskórne; 4) podskórnie. Reakcję kliniczną na alergen w teście alergicznym skórnym dzielimy na miejscową, uogólnioną i ogniskową oraz natychmiastową i opóźnioną.

Reakcje miejscowe typu mediatora HIT pojawiają się po 5-20 minutach, wyrażają się jako rumień i pęcherze, znikają po kilku godzinach, ocenia się metodą dodatnią na podstawie wielkości rumienia mierzonej w mm. Miejscowe reakcje na HTZ pojawiają się po 24–48 godzinach, trwają długo, pojawiają się w postaci nacieku, czasem z martwicą w środku i oceniane są na podstawie wielkości nacieku w mm, także metodą plusa. W cytotoksycznych i immunokompleksowych typach GNT przekrwienie i naciek obserwuje się po 3-4 godzinach, osiągając maksimum po 6-8 godzinach i ustępując po około jednym dniu. Czasami obserwuje się reakcje łączone.

1.3. REAKCJA wiązania dopełniacza (CFR)

Reakcję tę wykorzystuje się w badaniach laboratoryjnych do wykrywania przeciwciał w surowicy krwi w przypadku różnych infekcji, a także do identyfikacji patogenu na podstawie struktury antygenowej.

Test wiązania dopełniacza jest złożonym badaniem serologicznym, charakteryzującym się dużą czułością i swoistością.

Cechą tej reakcji jest to, że zmiana antygenu podczas jego interakcji ze specyficznymi przeciwciałami zachodzi tylko w obecności dopełniacza. Dopełniacz jest adsorbowany wyłącznie na kompleksie przeciwciało-antygen. Kompleks przeciwciało-antygen powstaje tylko wtedy, gdy istnieje powinowactwo pomiędzy antygenem a przeciwciałem obecnym w surowicy.

Adsorpcja dopełniacza na kompleksie „antygen-przeciwciało” może na różne sposoby wpływać na losy antygenu, w zależności od jego właściwości.

Niektóre antygeny ulegają w tych warunkach ostrym zmianom morfologicznym, aż do rozpuszczenia (hemoliza, zjawisko Isaeva-Pfeifera, działanie cytolityczne). Inne zmieniają prędkość ruchu (unieruchomienie krętka). Jeszcze inne umierają bez drastycznych zmian destrukcyjnych (działanie bakteriobójcze lub cytotoksyczne). Wreszcie, adsorpcji dopełniacza nie mogą towarzyszyć łatwo zauważalne zmiany w antygenie.

Zgodnie z mechanizmem RSC przebiega w dwóch fazach:

1. Pierwsza faza to utworzenie kompleksu „antygen-przeciwciało” i adsorpcja na tym kompleksie dopełniacza. Wynik fazy nie jest widoczny wizualnie (oddziaływanie antygenu i przeciwciał z obowiązkowym udziałem dopełniacza).
2. Druga faza to zmiana antygenu pod wpływem specyficznych przeciwciał w obecności dopełniacza. Wynik fazy może być widoczny lub niewidoczny wizualnie (wykrywanie wyników reakcji za pomocą wskaźnikowego układu hemolitycznego (erytrocyty owiec i surowica hemolityczna).

Zniszczenie erytrocytów przez surowicę hemolityczną następuje tylko w przypadku przyłączenia dopełniacza do układu hemolitycznego. Jeżeli dopełniacz został wcześniej zaadsorbowany na kompleksie antygen-przeciwciało, wówczas nie dochodzi do hemolizy erytrocytów.

Wynik doświadczenia ocenia się poprzez odnotowanie obecności lub braku hemolizy we wszystkich probówkach. Reakcję uważa się za pozytywną z całkowitym opóźnieniem hemolizy, gdy ciecz w probówce jest bezbarwna, a erytrocyty osiadają na dnie, ujemną z całkowitą lizą erytrocytów, gdy ciecz jest intensywnie zabarwiona („lakierowa” krew). Stopień opóźnienia hemolizy ocenia się w zależności od intensywności zabarwienia cieczy oraz ilości osadu erytrocytów na dnie (++++, +++, ++, +).

W przypadku, gdy zmiany w antygenie pozostają niedostępne dla obserwacji wizualnej, konieczne jest zastosowanie drugiego układu, który pełni rolę wskaźnika, który pozwala ocenić stan dopełniacza i wyciągnąć wniosek na temat wyniku reakcji.

Ten system wskaźników jest reprezentowany przez składniki reakcji hemolizy, która obejmuje erytrocyty owiec i surowicę hemolityczną zawierającą specyficzne przeciwciała przeciwko erytrocytom (hemolizyny), ale niezawierającą dopełniacza. Ten system wskaźników dodaje się do probówek godzinę po ustawieniu głównego CSC. Jeśli reakcja wiązania dopełniacza jest dodatnia, powstaje kompleks przeciwciało-antygen, który adsorbuje na sobie dopełniacz. Ponieważ dopełniacz stosuje się w ilości niezbędnej tylko do jednej reakcji, a liza erytrocytów może nastąpić tylko w obecności dopełniacza, to gdy zostanie on zaadsorbowany na kompleksie „przeciwciało antygenowe”, liza erytrocytów w układzie hemolitycznym (wskaźnikowym) nie nastąpi . Jeśli reakcja wiązania dopełniacza jest ujemna, nie tworzy się kompleks „przeciwciało antygenowe”, dopełniacz pozostaje wolny, a po dodaniu układu hemolitycznego następuje liza erytrocytów.

1.4. SONDY DNA. REAKCJA ŁAŃCUCHOWA POLIMERAZY (PCR),
METODA ODPORNOŚCI ENZYMATYCZNEJ (ELISA), METODA FLUORESCENCYJNA PRZECIWCIAŁA (MFA)

METODY BADANIA GENÓW

Intensywny rozwój biologii molekularnej i stworzenie doskonałych podstaw metodologicznych do badań genetycznych stały się podstawą inżynierii genetycznej. W dziedzinie diagnostyki powstał i prężnie rozwija się kierunek oznaczania określonych sekwencji nukleotydowych DNA i RNA, tzw. sondowanie genowe. Metody takie opierają się na zdolności kwasów nukleinowych do hybrydyzacji w celu utworzenia struktur dwuniciowych w wyniku oddziaływania komplementarnych nukleotydów (AT, GC).

Aby określić pożądaną sekwencję DNA (lub RNA), specjalnie tworzona jest tzw. sonda polinukleotydowa o określonej sekwencji zasad. Do jego składu wprowadzana jest specjalna etykieta, która umożliwia identyfikację powstawania kompleksu.

Chociaż sondowania genów nie można przypisać metodom analizy immunochemicznej, jego główna zasada (interakcja struktur komplementarnych) jest metodycznie realizowana w taki sam sposób, jak wskaźnikowe metody immunodiagnostyki. Ponadto metody sondowania genów umożliwiają uzupełnienie informacji o czynniku zakaźnym w przypadku braku jego ekspresji fenotypowej (wirusy wbudowane w genom, „ciche” geny).

Do analizy DNA próbkę poddaje się denaturacji w celu uzyskania struktur jednoniciowych, z którymi reagują cząsteczki DNA lub sondy RNA. Do przygotowania sond stosuje się albo różne odcinki DNA (lub RNA) wyizolowane z naturalnego źródła (na przykład tego lub innego mikroorganizmu), zwykle prezentowane jako sekwencje genetyczne jako część plazmidów wektorowych, albo chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy. W niektórych przypadkach jako sondę stosuje się preparaty genomowego DNA zhydrolizowanego na fragmenty, czasami preparaty RNA, szczególnie często rybosomalny RNA. Jako znacznik stosuje się te same wskaźniki, co w różnych typach analiz immunochemicznych: izotopy radioaktywne, fluoresceiny, biotop (z dalszą manifestacją kompleksu awidynoenzymu) itp.

Kolejność analiz zależy od właściwości dostępnej sondy

Obecnie coraz częściej stosuje się komercyjne zestawy zawierające wszystkie niezbędne składniki.

W większości przypadków procedurę analizy można podzielić na następujące etapy: przygotowanie próbki (w tym ekstrakcja i denaturacja DNA), utrwalenie próbki na nośniku (najczęściej polimerowym filtrze membranowym), prehybrydyzacja, sama hybrydyzacja, przemycie niezwiązanych produktów, wykrycie. W przypadku braku standardowego przygotowania sondy DNA lub RNA, najpierw jest ona uzyskiwana i znakowana.

W celu przygotowania próbki może zaistnieć konieczność „hodowania” materiału testowego w celu identyfikacji poszczególnych kolonii bakteryjnych lub zwiększenia stężenia wirusów w hodowli komórkowej. Przeprowadza się także bezpośrednią analizę próbek surowicy krwi, moczu, krwinek lub krwi pełnej na obecność czynnika zakaźnego. Aby uwolnić kwasy nukleinowe ze składu struktur komórkowych, komórki poddaje się lizie, a w niektórych przypadkach preparat DNA oczyszcza się za pomocą fenolu.

Denaturacja DNA, czyli jego przejście do formy jednoniciowej, następuje podczas traktowania alkaliami. Próbkę kwasu nukleinowego utrwala się następnie na nośniku z membraną nitrocelulozową lub nylonową, zwykle poprzez inkubację przez 10 minut do 4 godzin w temperaturze 80°C pod próżnią. Ponadto w procesie prehybrydyzacji osiąga się inaktywację wolnych miejsc wiązania, aby zmniejszyć niespecyficzne oddziaływanie sondy z membraną. Proces hybrydyzacji trwa od 2 do 20 godzin, w zależności od stężenia DNA w próbce, stężenia użytej sondy i jej wielkości.

Po zakończeniu hybrydyzacji i wypłukaniu niezwiązanych produktów wykrywa się powstały kompleks. Jeśli sonda zawiera znacznik radioaktywny, wówczas membranę naświetla się kliszą fotograficzną w celu zamanifestowania reakcji (autoradiografia). W przypadku innych etykiet należy zastosować odpowiednie procedury.

Najbardziej obiecująca jest produkcja sond nieradioaktywnych (tzw. zimnych). Na tej samej podstawie opracowywana jest technika hybrydyzacji, która pozwala na stwierdzenie obecności patogenu w preparatach skrawków, nakłuciach tkankowych, co jest szczególnie istotne w analizie patomorfologicznej (hybrydyzacja in situ).

Istotnym krokiem w rozwoju metod sondowania genów było zastosowanie reakcji amplifikacji polimerazy (PCR). Takie podejście umożliwia zwiększenie stężenia określonej (wcześniej znanej) sekwencji DNA w próbce poprzez syntezę wielu kopii in vitro. Aby przeprowadzić reakcję, do mieszaniny dodaje się preparat enzymatyczny polimerazy DNA, nadmiar deoksynukleotydów do syntezy oraz tzw. startery, dwa rodzaje oligonukleotydów o długości 20-25 zasad odpowiadające końcowym fragmentom interesującej sekwencji DNA. Badana próbka DNA. Jeden ze starterów musi być kopią początku obszaru odczytu kodującej nici DNA w kierunku odczytu 53, a drugi musi być kopią przeciwnego końca nici niekodującej. Następnie w każdym cyklu reakcji polimerazy liczba kopii DNA podwaja się.

Do związania starterów wymagana jest denaturacja (stopienie) DNA w temperaturze 94°C, a następnie doprowadzenie mieszaniny do temperatury 4055°C.

Aby przeprowadzić reakcję, zaprojektowano programowalne inkubatory do mikropróbek umożliwiające łatwe naprzemienne zmiany temperatury optymalne dla każdego etapu reakcji.

Reakcja amplifikacji może znacznie zwiększyć czułość analizy podczas sondowania genu, co jest szczególnie ważne przy niskich stężeniach czynnika zakaźnego.

Jedną z istotnych zalet sondowania genów z amplifikacją jest możliwość badania submikroskopowej ilości materiału patologicznego.

Kolejną cechą tej metody, ważniejszą dla analizy materiału zakaźnego, jest możliwość wykrycia ukrytych (cichych) genów. Metody związane z wykorzystaniem sondowań genowych z pewnością będą szerzej wprowadzane do praktyki diagnozowania chorób zakaźnych, gdyż staną się one prostsze i tańsze.

Metody ELISA i RIF są w większości metodami jakościowymi lub półilościowymi. Przy bardzo niskich stężeniach składników nie można wykryć tworzenia kompleksu antygen-przeciwciało ani wizualnie, ani za pomocą prostych środków instrumentalnych. Wskazanie kompleksu antygen-przeciwciało w takich przypadkach można przeprowadzić, jeśli jeden z początkowych składników antygen lub przeciwciało wprowadza znacznik, który można łatwo wykryć w stężeniach porównywalnych ze stężeniem oznaczanego analitu.

Jako znacznik można zastosować izotopy promieniotwórcze (na przykład 125I), substancje fluorescencyjne i enzymy.

W zależności od zastosowanego znacznika wyróżnia się metody analizy radioimmunologiczne (RIA), fluorescencyjne (FIA), enzymatyczne (ELISA) itp. W ostatnich latach test ELISA zyskał szerokie zastosowanie praktyczne, co wiąże się z możliwością oznaczeń ilościowych , wysoka czułość, specyfika i automatyzacja rachunkowości.

Metody analizy ELISA grupa metod umożliwiających wykrycie kompleksu antygen-przeciwciało przy użyciu substratu rozszczepianego przez enzym z pojawieniem się zabarwienia.

Istota metody polega na połączeniu składników reakcji antygenowo-przeciwciałowej z mierzonym znacznikiem enzymatycznym. Antygen lub przeciwciało, które reaguje, jest znakowane enzymem. Na podstawie transformacji substratu pod działaniem enzymu można ocenić ilość składnika reakcji antygen-przeciwciało, która weszła w interakcję. Enzym w tym przypadku służy jako marker odpowiedzi immunologicznej i pozwala na jej obserwację wzrokową lub instrumentalną.

Enzymy są bardzo wygodnymi etykietami, ponieważ ich właściwości katalityczne pozwalają im działać jako wzmacniacze, ponieważ jedna cząsteczka enzymu może wytworzyć więcej niż 1 x 105 cząsteczek produktu katalitycznego na minutę. Należy wybrać taki enzym, który długo zachowuje swoją aktywność katalityczną, nie traci jej po związaniu z antygenem lub przeciwciałem oraz posiada wysoką specyficzność względem substratu.

Główne metody otrzymywania przeciwciał lub antygenów znakowanych enzymem, koniugaty: inżynieria chemiczna, immunologiczna i genetyczna. Do testu ELISA najczęściej stosuje się enzymy: peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, galaktozydazę itp.

Do wykrycia aktywności enzymu w kompleksie antygen-przeciwciało w celu wizualnej i instrumentalnej rejestracji reakcji stosuje się substraty chromogenne, których roztwory początkowo bezbarwne, w trakcie reakcji enzymatycznej nabierają barwy, której intensywność jest proporcjonalna do ilości enzymu. I tak, do wykrycia aktywności peroksydazy chrzanowej w teście ELISA w fazie stałej, jako substrat stosuje się kwas 5aminosalicylowy, który daje intensywnie brązową barwę, ortofenylenodiaminę, która tworzy pomarańczowożółtą barwę. Do wykrywania aktywności fosfatazy alkalicznej i galatozydazy stosuje się odpowiednio nitrofenylofosforany i nitrofenylogalaktozydy.

Wynik reakcji, w wyniku której powstaje barwny produkt, określa się wizualnie lub za pomocą spektrofotometru, który mierzy absorpcję światła o określonej długości fali.

Istnieje wiele możliwości przeprowadzenia testu ELISA. Istnieją warianty homogeniczne i heterogeniczne.

Ze względu na sposób ustalania rozróżnia się konkurencyjne i niekonkurencyjne metody ELISA. Jeżeli na pierwszym etapie w ustroju obecny jest jedynie analizowany związek i odpowiadające mu centra wiążące (antygen i swoiste przeciwciała), to metoda jest niekonkurencyjna. Jeżeli analizowany związek (antygen) i jego analog (antygen znakowany enzymatycznie) występują w pierwszym etapie, konkurując ze sobą o wiązanie ze specyficznymi centrami wiążącymi (przeciwciałami) obecnymi w niedoborze, wówczas metoda jest konkurencyjna. W tym przypadku im więcej antygenu testowego zawiera roztwór, tym mniejsza jest ilość związanych, znakowanych antygenów.

METODA FLUORESCENCYJNA PRZECIWCIAŁA (MFA) lub REAKCJE IMMUNOFLUORESCENCYJNE (RIF)

Metoda immunofluorescencyjna jest metodą z wyboru umożliwiającą szybkie wykrycie i identyfikację nieznanego mikroorganizmu w badanym materiale.

Ag + AT + elektrolit = kompleks świetlny UV

Surowica drobnoustrojów znakowana fluorochromem

Często stosuje się barwnik izotiocyjanian fluoresceiny FITC

W tym badaniu wykorzystuje się mikroskop fluorescencyjny.

Inscenizacja RIF

Na rozmaz nanosi się 30 µl roztworu przeciwciał znakowanych FITC.

Umieścić szklankę w wilgotnej komorze i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20-25 minut lub w termostacie w temperaturze 37°C przez 15 minut.

Opłucz szybę pod bieżącą wodą kranową przez 2 min, spłucz wodą destylowaną i osusz na powietrzu.

Na wyschnięty rozmaz nanosi się kroplę płynu zamykającego, rozmaz przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym i ogląda pod mikroskopem przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego lub nasadki fluorescencyjnej do konwencjonalnego mikroskopu optycznego.

Reakcje aglutynacji
W reakcjach tych biorą udział antygeny w postaci cząstek (komórki drobnoustrojów, erytrocyty i inne antygeny korpuskularne), które sklejają się z przeciwciałami i wytrącają się.
Do wywołania reakcji aglutynacji (RA) potrzebne są trzy składniki: 1) antygen(aglutynogen); 2) przeciwciało(aglutynina) i 3) elektrolit(izotoniczny roztwór chlorku sodu).
Ag + AT + elektrolit = aglutynacja

1. Ustalenie przybliżenia reakcje aglutynacji (RA) na szkle w celu identyfikacji bakterii z grupy jelitowej.

Ryż. 2. RA na szkle.

Na szkiełko nakłada się krople:

1 - kropla: - surowica aglutynująca do patogenów czerwonki;
2 - kropla: - surowica aglutynująca do czynników wywołujących dur brzuszny;
3 -ta kropla: - roztwór soli (kontrola).
Dodaj do każdej kropli przetestował czystą kulturę bakterii . Zamieszać.

Notatka: wynik pozytywny – obecność płatków zlepionych,
negatywny - brak płatków aglutynować
Wniosek: Badane bakterie są czynnikiem wywołującym dur brzuszny.

2. Rozliczanie wyników RNGA zestaw do wykrywania toksyny botulinowej.

Czynnik wywołujący botulizm Clostridium botulinowe wytwarza toksyny siedmiu serotypów (A, B, C, D, E, F, G), przy czym częściej niż inne występują serotypy A, B, E. Wszystkie toksyny różnią się właściwościami antygenowymi i można je różnicować w reakcjach surowice specyficzne dla typu. W tym celu można przeprowadzić bierną (pośrednią) reakcję hemaglutynacji z surowicą pacjenta, w której spodziewana jest obecność toksyny, oraz z erytrocytami obciążonymi przeciwciałami antytoksycznymi antybotulinowymi surowicami typu A, B, E. Normalny surowica służy jako kontrola.

Ryż. 3. Oświadczenie i wynik RNGA.

Księgowość parasol guziki lub kółeczko.

Wniosek: W surowicy pacjenta wykryto toksynę botulinową typu E.

Reakcja wytrącania - jest to tworzenie i wytrącanie kompleksu rozpuszczalnego antygenu molekularnego z przeciwciałami w postaci chmury zwanej osadem. Powstaje przez zmieszanie antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach. Reakcję wytrącania umieszcza się w probówkach (reakcja wytrącania pierścieniowego), w żelach, pożywkach itp.

3. Ustawianie i rozliczanie reakcji opady pierścieniowe w celu określenia rodzaju plamy krwi.

inscenizacja . W wąskiej probówce nr 1 o średnicy 0,5 cm z nierozcieńczonym osadem surowica przeciwko białkom ludzkiej krwi w ilości 0,3-0,5 ml, trzymając go w pozycji pochylonej, taką samą objętość antygenu powoli rozprowadza się wzdłuż ścianki za pomocą pipety Pasteura ( ekstrakt z plamy krwi). Surowicę strącającą przeciwko białkom owczym wlewa się do probówki nr 2, do probówki nr 3 - solankowy(kontrola) i dodać antygen w taki sam sposób jak w pierwszej probówce. Probówki ustawia się ostrożnie pionowo, tak aby nie wymieszać cieczy. Przy prawidłowym nałożeniu precypitynogenu na surowicę granica pomiędzy dwiema warstwami cieczy jest wyraźnie zaznaczona. Reakcji koniecznie towarzyszy kontrola surowicy i antygenu.
Księgowość . Wyniki reakcji uwzględnia się w zależności od rodzaju antygenu i przeciwciał po 5-10 minutach, 1-2 godzinach lub po 20-24 godzinach. pozytywny reakcji w probówce, na granicy surowicy i badanego ekstraktu pojawia się osad w postaci białego pierścienia.

Ryż. 4. Reakcja wytrącania pierścienia.

4. Oznaczanie toksyczności Corynebacterium diphtheria u reakcje strącania agaru.

Tę długo stosowaną reakcję strącania, zaproponowaną do określenia toksyczności Corynebacterium diphtheria, umieszcza się na agarze fosforanowo-peptonowym na szalce Petriego. Pasek sterylnej bibuły filtracyjnej zwilżonej serum antytoksyczne. Po wysuszeniu, w odległości 1 cm od krawędzi paska, wyizolowane kultury zaszczepia się łysinkami o średnicy 10 mm. W jednym kubku można wysiać od 3 do 10 roślin, z których jedna, kontrola, musi być znana jako trująca. Uprawy umieszcza się w termostacie.

Księgowość reakcje przeprowadza się po 24-48-72 h. Jeśli kultura jest toksyczna, w pewnej odległości od paska papieru pojawiają się linie osadu, pokrywające się z liniami osadu kultury kontrolnej. Wyglądają na " strzałki wąsów”, które są wyraźnie widoczne w świetle przechodzącym.

Ryż. 5. Reakcja wytrącania na agarze.

REAKCJE IMMUNOLOGICZNE W CELU WYKRYCIA SWOICH PRZECIWCIAŁ

5. Inscenizacja pośrednia reakcja hemaglutynacji (RNGA) wykrycie miana swoistych przeciwciał u pacjenta.

W biernej reakcji hemaglutynacji (RPHA) jako nośnik wykorzystywane są erytrocyty. Erytrocyty obciążone antygenem sklejają się w obecności specyficznych przeciwciał przeciwko temu antygenowi i wytrącają się. W RPHA as stosuje się erytrocyty uwrażliwione na antygen diagnostyka erytrocytów do wykrywania przeciwciał (serodiagnoza).
inscenizacja . W dołkach tabletek styropianowych przygotować serię seryjnych rozcieńczeń surowicy. Do przedostatniego dołka wlać 0,5 ml znanej surowicy dodatniej, a do ostatniego 0,5 ml soli fizjologicznej (kontrola). Następnie do wszystkich dołków dodaje się 0,1 ml rozcieńczonego erytrocytu diagnostycznego, wytrząsa i umieszcza w termostacie na 2 godziny.
Księgowość . W przypadku wyniku pozytywnego czerwone krwinki osiadają na dnie studzienki równą warstwą komórek o zagiętej lub ząbkowanej krawędzi (odwróconej parasol), w negatywnym - rozstrzygnij w formie guziki lub kółeczko.

Ryż. 6. Wynik RNGA. Miano przeciwciał - 1:100.

6. Inscenizacja przedłużona reakcja aglutynacji w celu określenia miana swoistych przeciwciał u pacjenta.

Rozszerzone RZS do serodiagnostyki umieszcza się w surowicy pacjentów. Rozcieńcza się go w izotonicznym roztworze chlorku sodu od 1:50 - 1:100 do 1:800 lub 1:1600. Ponieważ niższe miana surowicy mogą zawierać normalne aglutyniny, które występują u osób zdrowych lub pacjentów z inną diagnozą ( miano diagnostyczne). Jako antygen w tej reakcji stosuje się środki diagnostyczne - z reguły znane zawiesiny zabitych bakterii, z którymi można bezpiecznie pracować.
Włożyli reakcja w następujący sposób. Do probówek aglutynacyjnych wlewa się wstępnie 1 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do pierwszego z nich dodaje się 1 ml surowicy rozcieńczonej 1:100, po wymieszaniu 1 ml przenosi się do drugiego, z drugiego do trzeciego itd. Do otrzymanych dwukrotnych rozcieńczeń surowic (od 1:100 do 1:1600 lub więcej) dodaje się 1-2 krople zawiesiny bakterii zawierającej 3 miliardy ciał drobnoustrojów w 1 ml. Probówki wytrząsa się i umieszcza w termostacie w temperaturze 37°C na 2 godziny, następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej na jeden dzień.

Księgowość reakcje rozszerzonej aglutynacji przeprowadza się oceniając kolejno każdą probówkę, zaczynając od kontrolnych, delikatnie wstrząsając. W probówkach kontrolnych nie powinno być żadnej aglutynacji. Intensywność reakcji aglutynacji oznacza się następującymi znakami: ++++ - całkowita aglutynacja ( aglutynujące płatki w absolutnie przezroczystej cieczy). +++ - niepełna aglutynacja (płatki w lekko opalizującej cieczy); ++ - częściowa aglutynacja(płatki są wyraźnie widoczne, płyn jest lekko mętny); + - słaba, wątpliwa aglutynacja - ciecz jest bardzo mętna, zawarte w niej płatki są słabo rozróżnialne; - - brak aglutynacji (ciecz jest jednolicie mętna).
Za miano pobiera się serum jej ostatnia hodowla, w którym intensywność aglutynacji szacuje się na co najmniej dwa plusy (++)

Ryż. 7. Reakcja przedłużonej aglutynacji.

Pojęcie odporności oznacza odporność organizmu na wszelkie czynniki obce genetycznie, w tym patogeny i ich trucizny (od łac. immunitas – wyzwolenie od czegoś).

Kiedy do organizmu dostają się obce genetycznie struktury (antygeny), uruchamia się szereg mechanizmów i czynników, które rozpoznają i neutralizują te obce dla organizmu substancje.

Układ narządów i tkanek realizujący reakcje obronne organizmu przed naruszeniem stałości jego środowiska wewnętrznego (homeostazy) nazywany jest układem odpornościowym.

Nauka o odporności - immunologia bada reakcje organizmu na obce substancje, w tym mikroorganizmy; reakcje organizmu na obce tkanki (zgodność) i nowotwory złośliwe; określa immunologiczne grupy krwi itp. Podstawy immunologii położyły spontaniczne obserwacje starożytnych na temat możliwości sztucznej ochrony człowieka przed chorobą zakaźną. Obserwacje osób, które znalazły się w centrum uwagi epidemii, doprowadziły do ​​wniosku, że nie wszyscy chorują. Zatem ci, którzy wyzdrowieli z tej choroby, nie chorują na dżumę; na odrę zwykle choruje się raz w dzieciństwie; ci, którzy mieli ospę krowią, nie chorują na ospę prawdziwą itp.

Znane są metody starożytnych ludów chroniące przed ukąszeniami węży poprzez wcieranie w nacięcia na skórze roślin natartych jadem węża; w celu ochrony stad przed zapaleniem płuc bydła, wykonując także nacięcia na skórze sztyletem, uprzednio zanurzonym w płucach byka, który zmarł na tę chorobę.

E. Jenner (1876) dokonał pierwszej sztucznej szczepionki zapobiegającej infekcjom. Jednak dopiero L. Pasteur był w stanie naukowo uzasadnić zasady sztucznej ochrony przed chorobami zakaźnymi. Udowodnił, że zakażenie osłabionymi patogenami prowadzi do odporności organizmu przy wielokrotnym kontakcie z tymi mikroorganizmami.

Pasteur opracował leki zapobiegające wąglikowi i wściekliźnie.

Immunologia doczekała się dalszego rozwoju w pracach I. I. Mechnikova na temat znaczenia odporności komórkowej (fagocytoza) i P. Ehrlicha na temat roli czynników humoralnych (płynów ustrojowych) w rozwoju odporności.

Obecnie immunologia jest nauką, w której ochrona przed chorobami zakaźnymi jest tylko jednym z ogniw. Wyjaśnia przyczyny niezgodności i odrzucenia tkanek podczas przeszczepiania narządów, śmierć płodu w sytuacji konfliktu Rh, powikłania podczas transfuzji krwi, rozwiązuje problemy medycyny sądowej itp.

Główne rodzaje odporności pokazano na schemacie.

Odporność dziedziczna (gatunkowa).

Odporność dziedziczna (gatunkowa) jest najtrwalszą i doskonałą formą odporności, która wynika z dziedzicznych czynników odporności (odporności).

Wiadomo, że człowiek jest odporny na zarazę psów i bydła, a zwierzęta nie chorują na cholerę i błonicę. Odporność dziedziczna nie jest jednak absolutna: tworząc specjalne, niekorzystne warunki dla makroorganizmu, można zmienić jego odporność. Na przykład przegrzanie, ochłodzenie, beri-beri, działanie hormonów prowadzi do rozwoju choroby, która jest zwykle nietypowa dla osoby lub zwierzęcia. Tak więc Pasteur, schładzając kurczaki, spowodował u nich sztuczną infekcję wąglikiem, na którą w normalnych warunkach nie chorują.

odporność nabyta

Odporność nabyta u człowieka kształtuje się przez całe życie, nie jest dziedziczona.

naturalna odporność. Odporność czynna powstaje po chorobie (nazywa się ją poinfekcyjną). W większości przypadków utrzymuje się długo: po odrze, ospie wietrznej, zarazie itp. Jednak po niektórych chorobach czas trwania odporności jest krótki i nie przekracza jednego roku (grypa, czerwonka itp.). Czasami naturalna odporność czynna rozwija się bez widocznej choroby. Powstaje w wyniku utajonej (utajonej) infekcji lub powtarzającej się infekcji małymi dawkami patogenu, które nie powodują wyraźnej choroby (ułamkowa, szczepionka domowa).

Odporność bierna to odporność noworodków (łożyskowa), nabyta przez nie przez łożysko podczas rozwoju płodu. Noworodki mogą również uzyskać odporność dzięki mleku matki. Ten rodzaj odporności jest krótkotrwały i z reguły zanika po 6-8 miesiącach. Ogromne znaczenie ma jednak naturalna odporność bierna, która zapewnia odporność niemowląt na choroby zakaźne.

sztuczna odporność. Osoba nabywa odporność czynną w wyniku uodpornienia (szczepień). Ten rodzaj odporności rozwija się po wprowadzeniu do organizmu bakterii, ich trucizn, wirusów, osłabionych lub zabitych na różne sposoby (szczepienia przeciwko krztuścowi, błonicy, ospie).

Jednocześnie w organizmie zachodzi aktywna restrukturyzacja mająca na celu tworzenie substancji, które mają szkodliwy wpływ na patogen i jego toksyny (przeciwciała). Następuje także zmiana właściwości komórek, które niszczą mikroorganizmy i produkty ich przemiany materii. Rozwój odporności czynnej następuje stopniowo przez 3-4 tygodnie i utrzymuje się stosunkowo długo – od 1 do 3-5 lat.

Odporność bierna powstaje poprzez wprowadzenie do organizmu gotowych przeciwciał. Ten rodzaj odporności pojawia się natychmiast po wprowadzeniu przeciwciał (surowic i immunoglobulin), ale trwa tylko 15-20 dni, po czym przeciwciała są niszczone i wydalane z organizmu.

Pojęcie „immunitetu lokalnego” wprowadził A. M. Bezredka. Uważał, że poszczególne komórki i tkanki organizmu mają pewną podatność. Uodparniając je, tworzą niejako barierę dla przenikania czynników zakaźnych. Obecnie udowodniono jedność odporności lokalnej i ogólnej. Jednak znaczenie odporności poszczególnych tkanek i narządów na mikroorganizmy nie budzi wątpliwości.

Oprócz powyższego podziału odporności ze względu na pochodzenie, istnieją formy odporności skierowane na różne antygeny.

Odporność przeciwdrobnoustrojowa rozwija się w chorobach wywołanych przez różne mikroorganizmy lub po wprowadzeniu szczepionek korpuskularnych (z żywych, osłabionych lub zabitych mikroorganizmów).

Odporność antytoksyczna powstający w związku z truciznami bakteryjnymi – toksynami.

Odporność przeciwwirusowa powstały po chorobach wirusowych. Ten typ odporności jest przeważnie długotrwały i trwały (odra, ospa wietrzna itp.). Odporność przeciwwirusowa rozwija się także po zaszczepieniu szczepionkami wirusowymi.

Ponadto odporność można podzielić w zależności od okresu uwalniania organizmu z patogenu.

Sterylna odporność. Większość patogenów znika z organizmu, gdy dana osoba wraca do zdrowia. Ten rodzaj odporności nazywa się jałowym (odra, ospa itp.).

Niesterylna odporność. Podatność na czynnik wywołujący infekcję utrzymuje się jedynie przez czas jego przebywania w organizmie żywiciela. Taka odporność nazywana jest niesterylną lub zakaźną. Ten typ odporności obserwuje się w przypadku gruźlicy, kiły i niektórych innych infekcji.

Pytania kontrolne

1. Czym jest odporność?

2. Jakie znasz formy odporności?

Odporność człowieka na choroby zakaźne wynika z połączonego działania nieswoistych i swoistych czynników ochronnych.

Niespecyficzne to wrodzone właściwości organizmu, które przyczyniają się do niszczenia szerokiej gamy mikroorganizmów na powierzchni ludzkiego ciała i w jego jamach.

Rozwój specyficznych czynników obronnych następuje po kontakcie organizmu z patogenami lub toksynami; działanie tych czynników jest skierowane wyłącznie przeciwko tym patogenom lub ich toksynom.

Nieswoiste czynniki obronne organizmu

Istnieją czynniki mechaniczne, chemiczne i biologiczne, które chronią organizm przed szkodliwym działaniem różnych mikroorganizmów.

Skóra. Nienaruszona skóra stanowi barierę dla wnikania mikroorganizmów. W tym przypadku ważne są czynniki mechaniczne: odrzucenie nabłonka oraz wydzielanie gruczołów łojowych i potowych, które przyczyniają się do usuwania mikroorganizmów ze skóry.

Rolę chemicznych czynników ochronnych pełnią także wydzieliny gruczołów skórnych (łojowych i potowych). Zawierają kwasy tłuszczowe i mlekowe, które działają bakteriobójczo (zabijają bakterie).

Biologiczne czynniki ochronne wynikają ze szkodliwego wpływu prawidłowej mikroflory skóry na mikroorganizmy chorobotwórcze.

błony śluzowe różne narządy są jedną z barier wnikania mikroorganizmów. W drogach oddechowych ochrona mechaniczna odbywa się za pomocą nabłonka rzęskowego. Ruch rzęsek nabłonka górnych dróg oddechowych powoduje ciągłe przesuwanie filmu śluzowego wraz z różnymi mikroorganizmami w kierunku naturalnych otworów: jamy ustnej i przewodów nosowych. Włosy w drogach nosowych mają taki sam wpływ na bakterie. Kaszel i kichanie pomagają usunąć mikroorganizmy i zapobiegają ich aspiracji (inhalacji).

Łzy, ślina, mleko matki i inne płyny ustrojowe zawierają lizozym. Działa destrukcyjnie (chemicznie) na mikroorganizmy. Kwaśne środowisko treści żołądkowej wpływa również na mikroorganizmy.

Prawidłowa mikroflora błon śluzowych, jako czynnik ochrony biologicznej, jest antagonistą mikroorganizmów chorobotwórczych.

Pytania kontrolne

1. Czym są niespecyficzne czynniki ochronne?

2. Jakie czynniki uniemożliwiają przenikanie drobnoustrojów chorobotwórczych przez skórę i błony śluzowe?

Zapalenie- reakcja makroorganizmu na cząstki obce wnikające do jego środowiska wewnętrznego. Jedną z przyczyn zapalenia jest wprowadzenie czynników zakaźnych do organizmu. Rozwój stanu zapalnego prowadzi do zniszczenia mikroorganizmów lub uwolnienia się od nich.

Zapalenie charakteryzuje się naruszeniem krążenia krwi i limfy w uszkodzeniu. Towarzyszy mu gorączka, obrzęk, zaczerwienienie i ból.

Komórkowe niespecyficzne czynniki obronne

Fagocytoza

Jednym z głównych mechanizmów zapalenia jest fagocytoza – proces wchłaniania bakterii.

Zjawisko fagocytozy po raz pierwszy opisał I. I. Miecznikow. Zaczął badać fagocytozę jednokomórkowej ameby, dla której fagocytoza jest sposobem trawienia pokarmu. Śledząc ten proces na różnych etapach rozwoju świata zwierząt, I. I. Mechnikov zakończył go odkryciem wyspecjalizowanych komórek ludzkich, za pomocą których następuje niszczenie bakterii, resorpcja martwych komórek, ogniska krwotoków itp. wielkie znaczenie.

Różne komórki organizmu (leukocyty krwi, komórki śródbłonka naczyń krwionośnych) wykazują aktywność fagocytarną. Aktywność ta jest najbardziej widoczna w ruchomych leukocytach wielojądrzastych, monocytach krwi i makrofagach tkankowych oraz w mniejszym stopniu w komórkach szpiku kostnego. Wszystkie jednojądrzaste komórki fagocytarne (i ich prekursory szpiku kostnego) są połączone w system jednojądrzastych fagocytów (MPS).

Komórki fagocytarne mają lizosomy zawierające ponad 25 różnych enzymów hydrolitycznych i białek o właściwościach antybakteryjnych.

Etapy fagocytozy. Etap 1 - podejście fagocytu do obiektu ze względu na działanie chemiczne tego ostatniego. Ruch ten nazywany jest pozytywną chemotaksją (w stronę obiektu).

Etap 2 - adhezja mikroorganizmów do fagocytów.

Etap 3 - wchłanianie mikroorganizmów przez komórkę, tworzenie fagosomów.

Etap 4 - tworzenie fagolizosomu, do którego wchodzą enzymy i białka bakteriobójcze, śmierć i trawienie patogenu.

Proces kończący się śmiercią fagocytozowanych drobnoustrojów nazywa się fagocytozą całkowitą.

Jednak niektóre mikroorganizmy znajdujące się wewnątrz fagocytów nie umierają, a czasem nawet się w nich rozmnażają. Są to gonokoki, Mycobacterium tuberculosis, Brucella. Zjawisko to nazywa się niepełną fagocytozą; podczas gdy fagocyty umierają.

Podobnie jak inne funkcje fizjologiczne, fagocytoza zależy od stanu organizmu - regulacyjnej roli ośrodkowego układu nerwowego, odżywiania, wieku.

Aktywność fagocytarna leukocytów zmienia się w wielu, często niezakaźnych chorobach. Określając szereg wskaźników fagocytozy, można ustalić przebieg choroby - powrót do zdrowia lub pogorszenie stanu pacjenta, skuteczność leczenia itp.

Aby ocenić stan funkcjonalny fagocytów, aktywność absorpcyjną określa się najczęściej za pomocą dwóch testów: 1) wskaźnik fagocytarny – odsetek komórek fagocytarnych (liczba leukocytów z wchłoniętymi drobnoustrojami na 100 zaobserwowanych); 2) liczba fagocytarna - średnia liczba drobnoustrojów lub innych obiektów fagocytozy wchłoniętych przez jeden leukocyt.

Zdolność bakteriobójcza fagocytów zależy od liczby lizosomów, aktywności enzymów wewnątrzkomórkowych i innych metod.

Aktywność fagocytozy związana jest z obecnością w surowicy krwi przeciwciał – opsonin. Przeciwciała te wzmagają fagocytozę, przygotowując powierzchnię komórki do absorpcji przez fagocyt.

Aktywność fagocytozy w dużej mierze determinuje odporność organizmu na dany patogen. W niektórych chorobach fagocytoza jest głównym czynnikiem ochronnym, w innych pomocniczym. Jednak we wszystkich przypadkach brak zdolności fagocytarnej komórek dramatycznie pogarsza przebieg i rokowanie choroby.

Reaktywność komórkowa

Rozwój procesu zakaźnego i powstawanie odporności są całkowicie zależne od pierwotnej wrażliwości komórek na patogen. Dziedziczna odporność gatunkowa jest przykładem braku wrażliwości komórek jednego gatunku zwierząt na mikroorganizmy chorobotwórcze dla innych. Mechanizm tego zjawiska nie jest dobrze poznany. Wiadomo, że reaktywność komórek zmienia się wraz z wiekiem i pod wpływem różnych czynników (fizycznych, chemicznych, biologicznych).

Pytania kontrolne

1. Co to jest fagocytoza?

2. Jakie znasz etapy fagocytozy?

3. Co to jest fagocytoza całkowita i niepełna?

Czynniki humoralne niespecyficznej ochrony

Oprócz fagocytów we krwi znajdują się rozpuszczalne niespecyficzne substancje, które mają szkodliwy wpływ na mikroorganizmy. Należą do nich dopełniacz, właściwadyna, β-lizyna, x-lizyna, erytryna, leukiny, plakiny, lizozym itp.

Dopełniacz (od łac. complementum – addycja) to złożony układ frakcji białkowych krwi, który ma zdolność lizy mikroorganizmów i innych komórek obcych, np. czerwonych krwinek. Istnieje kilka składników dopełniacza: C 1, C 2, C 3 itp. Dopełniacz ulega zniszczeniu w temperaturze 55 ° C przez 30 minut. Ta właściwość nazywa się termolabilnością. Ulega także zniszczeniu pod wpływem wstrząsów, promieni UV itp. Oprócz surowicy krwi dopełniacz występuje w różnych płynach ustrojowych oraz w wysięku zapalnym, nie ma go jednak w przedniej komorze oka i płynie mózgowo-rdzeniowym.

Properdin (od łac. Properde – przygotować) to grupa składników prawidłowej surowicy krwi, która w obecności jonów magnezu aktywuje dopełniacz. Jest podobny do enzymów i odgrywa ważną rolę w odporności organizmu na infekcje. Spadek poziomu propedyny w surowicy krwi wskazuje na niedostateczną aktywność procesów odpornościowych.

β-lizyny to termostabilne (odporne na temperaturę) substancje występujące w surowicy krwi ludzkiej, wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe, głównie wobec bakterii Gram-dodatnich. Zniszczony w temperaturze 63°C i pod działaniem promieni UV.

X-lizyna jest termostabilną substancją izolowaną z krwi pacjentów z wysoką gorączką. Posiada zdolność do uzupełniania bakterii lizowych, głównie Gram-ujemnych, bez udziału. Wytrzymuje nagrzewanie do 70-100°C.

Erytryna wyizolowana z erytrocytów zwierzęcych. Działa bakteriostatycznie na patogeny błonicy i niektóre inne mikroorganizmy.

Leukiny to substancje bakteriobójcze izolowane z leukocytów. Termostabilny, ulega zniszczeniu w temperaturze 75-80°C. Występuje we krwi w bardzo małych ilościach.

Plakiny to substancje podobne do leukin izolowane z płytek krwi.

Lizozym jest enzymem niszczącym błonę komórkową drobnoustrojów. Występuje we łzach, ślinie, płynach krwi. Szybkie gojenie ran spojówki oka, błon śluzowych jamy ustnej i nosa wynika w dużej mierze z obecności lizozymu.

Składniki moczu, płynu prostaty, ekstraktów różnych tkanek mają również właściwości bakteriobójcze. Normalna surowica zawiera niewielką ilość interferonu.

Pytania kontrolne

1. Czym są humoralne, nieswoiste czynniki obronne?

2. Jakie znasz humoralne czynniki nieswoistej obrony?

Specyficzne czynniki obronne organizmu (odporność)

Wymienione powyżej składniki nie wyczerpują całego arsenału humoralnych czynników ochronnych. Najważniejsze z nich to swoiste przeciwciała – immunoglobuliny, które powstają w wyniku wprowadzenia do organizmu obcych czynników – antygenów.

Antygeny

Antygeny to substancje genetycznie obce organizmowi (białka, nukleoproteiny, polisacharydy itp.), na których wprowadzenie organizm reaguje rozwojem specyficznych reakcji immunologicznych. Jedną z tych reakcji jest tworzenie przeciwciał.

Antygeny mają dwie główne właściwości: 1) immunogenność, tj. zdolność powodowania tworzenia przeciwciał i limfocytów odpornościowych; 2) zdolność do wchodzenia w specyficzną interakcję z przeciwciałami i odpornymi (uczulonymi) limfocytami, co objawia się w postaci reakcji immunologicznych (neutralizacja, aglutynacja, liza itp.). Antygeny posiadające obie cechy nazywane są antygenami kompletnymi. Należą do nich obce białka, surowice, elementy komórkowe, toksyny, bakterie, wirusy.

Substancje, które nie powodują reakcji immunologicznych, w szczególności wytwarzania przeciwciał, ale wchodzą w specyficzną interakcję z gotowymi przeciwciałami, nazywane są haptenami – antygenami defektywnymi. Hapteny nabywają właściwości pełnoprawnych antygenów po połączeniu z substancjami wielkocząsteczkowymi - białkami, polisacharydami.

Warunki określające właściwości antygenowe różnych substancji to: obcość, makromolekularność, stan koloidalny, rozpuszczalność. Antygenowość objawia się w momencie przedostania się substancji do środowiska wewnętrznego organizmu, gdzie spotyka się z komórkami układu odpornościowego.

Specyficzność antygenów, ich zdolność do łączenia się jedynie z odpowiednim przeciwciałem, jest unikalnym zjawiskiem biologicznym. Leży u podstaw mechanizmu utrzymania stałości środowiska wewnętrznego organizmu. Trwałość tę zapewnia układ odpornościowy, który rozpoznaje i niszczy substancje obce genetycznie (w tym mikroorganizmy, ich trucizny) znajdujące się w jego środowisku wewnętrznym. Ludzki układ odpornościowy podlega stałemu nadzorowi immunologicznemu. Potrafi rozpoznać obcość, gdy komórki różnią się tylko jednym genem (rak).

Specyficzność to cecha struktury substancji, w której antygeny różnią się od siebie. Decyduje o tym determinanta antygenowa, czyli niewielka część cząsteczki antygenu, która jest połączona z przeciwciałem. Liczba takich miejsc (grup) jest różna dla różnych antygenów i określa liczbę cząsteczek przeciwciał, z którymi antygen może się związać (wartościowość).

Zdolność antygenów do łączenia się tylko z tymi przeciwciałami, które powstały w odpowiedzi na aktywację układu odpornościowego przez ten antygen (swoistość) wykorzystywana jest w praktyce: 1) diagnostyce chorób zakaźnych (oznaczenie antygenów specyficznych patogenów lub swoistych przeciwciał w organizmie) surowica krwi pacjenta); 2) profilaktyka i leczenie pacjentów z chorobami zakaźnymi (tworzenie odporności na niektóre drobnoustroje lub toksyny, specyficzna neutralizacja trucizn patogenów szeregu chorób podczas immunoterapii).

Układ odpornościowy wyraźnie rozróżnia antygeny „własne” i „obce”, reagując tylko na te drugie. Możliwe są jednak reakcje na własne antygeny organizmu – autoantygeny i pojawienie się przeciwko nim przeciwciał – autoprzeciwciał. Antygeny „barierowe” stają się autoantygenami – komórkami, substancjami, które w ciągu życia człowieka nie mają kontaktu z układem odpornościowym (soczewka oka, plemniki, tarczyca itp.), ale mają z nim kontakt podczas różnych urazów, zwykle wchłaniany do krwi. A ponieważ w trakcie rozwoju organizmu antygeny te nie zostały rozpoznane jako „własne”, nie wytworzyła się naturalna tolerancja (specyficzny brak odpowiedzi immunologicznej), tj. komórki układu odpornościowego pozostały w organizmie zdolne do odpowiedzi immunologicznej na te własne antygeny.

W wyniku pojawienia się autoprzeciwciał mogą rozwinąć się choroby autoimmunologiczne w wyniku: 1) bezpośredniego cytotoksycznego działania autoprzeciwciał na komórki odpowiednich narządów (na przykład wole Hashimoto - uszkodzenie tarczycy); 2) pośrednie działanie kompleksów autoantygen-autoprzeciwciało, które odkładają się w zaatakowanym narządzie i powodują uszkodzenia (na przykład toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów).

Antygeny mikroorganizmów. Komórka drobnoustroju zawiera dużą liczbę antygenów, które mają różne lokalizacje w komórce i różne znaczenie dla rozwoju procesu zakaźnego. Różne grupy mikroorganizmów mają różny skład antygenów. W bakteriach jelitowych dobrze zbadano antygeny O, K, H.

Antygen O jest związany ze ścianą komórkową komórki drobnoustroju. Nazywano go zwykle „somatycznym”, ponieważ wierzono, że antygen ten jest zamknięty w ciele (somie) komórki. Antygen O bakterii Gram-ujemnych jest złożonym kompleksem lipopolisacharydowo-białkowym (endotoksyną). Jest termostabilny, nie zapada się pod wpływem alkoholu i formaliny. Składa się z głównego jądra (rdzenia) i bocznych łańcuchów polisacharydowych. Specyficzność antygenów O zależy od struktury i składu tych łańcuchów.

Antygeny K (otoczkowe) są związane z otoczką i ścianą komórkową komórki drobnoustroju. Nazywa się je również muszlami. Antygeny K są zlokalizowane bardziej powierzchownie niż antygeny O. Są to głównie kwaśne polisacharydy. Istnieje kilka rodzajów antygenów K: A, B, L itp. Antygeny te różnią się między sobą odpornością na działanie temperatury. Antygen A jest najbardziej stabilny, L - najmniej. Do antygenów powierzchniowych zalicza się także antygen Vi, który występuje w patogenach duru brzusznego i niektórych innych bakteriach jelitowych. Ulega zniszczeniu w temperaturze 60° C. Obecność antygenu Vi powiązano ze zjadliwością mikroorganizmów.

Antygeny H (wiciowce) zlokalizowane są w wici bakterii. Są specjalnym białkiem – flageliną. Rozpadają się pod wpływem ogrzewania. Po obróbce formaliną zachowują swoje właściwości (patrz ryc. 70).

Antygen ochronny (ochronny) (od łac. Protectio - patronat, ochrona) jest tworzony przez patogeny w organizmie pacjenta. Czynniki wywołujące wąglik, dżumę, brucelozę są w stanie wytworzyć antygen ochronny. Występuje w wysiękach dotkniętych tkanek.

Wykrywanie antygenów w materiale patologicznym jest jedną z metod diagnostyki laboratoryjnej chorób zakaźnych. Do wykrycia antygenu wykorzystuje się różne odpowiedzi immunologiczne (patrz poniżej).

Wraz z rozwojem, wzrostem i rozmnażaniem mikroorganizmów ich antygeny mogą się zmieniać. Następuje utrata niektórych składników antygenowych, zlokalizowanych bardziej powierzchownie. Zjawisko to nazywa się dysocjacją. Przykładem jest dysocjacja „S” - „R”.

Pytania kontrolne

1. Czym są antygeny?

2. Jakie są główne właściwości antygenów?

3. Jakie antygeny komórek drobnoustrojów znasz?

Przeciwciała

Przeciwciała to specyficzne białka krwi – immunoglobuliny, które powstają w odpowiedzi na wprowadzenie antygenu i są w stanie specyficznie z nim reagować.

W surowicy ludzkiej występują dwa rodzaje białek: albuminy i globuliny. Przeciwciała kojarzone są głównie z globulinami modyfikowanymi antygenem i nazywanymi immunoglobulinami (Ig). Globuliny są heterogenne. W zależności od prędkości ruchu w żelu, gdy przepływa przez niego prąd elektryczny, dzieli się je na trzy frakcje: α, β, γ. Przeciwciała należą głównie do γ-globulin. Ta frakcja globulin charakteryzuje się największą prędkością poruszania się w polu elektrycznym.

Immunoglobuliny charakteryzują się masą cząsteczkową, szybkością sedymentacji podczas ultrawirowania (wirowanie z bardzo dużą prędkością) itp. Różnice w tych właściwościach pozwoliły podzielić immunoglobuliny na 5 klas: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Wszystkie odgrywają rolę w rozwoju odporności na choroby zakaźne.

Immunoglobuliny G (IgG) stanowią około 75% wszystkich immunoglobulin ludzkich. Są najbardziej aktywne w rozwoju odporności. Jedyne immunoglobuliny przenikają przez łożysko, zapewniając bierną odporność płodu. Mają małą masę cząsteczkową i szybkość sedymentacji podczas ultrawirowania.

Immunoglobuliny M (IgM) są wytwarzane u płodu i jako pierwsze pojawiają się po zakażeniu lub uodpornieniu. Do tej klasy zaliczają się „normalne” przeciwciała ludzkie, które powstają w trakcie jego życia, bez widocznych objawów infekcji lub podczas powtarzających się infekcji domowych. Mają wysoką masę cząsteczkową i szybkość sedymentacji podczas ultrawirowania.

Immunoglobuliny A (IgA) mają zdolność przenikania do wydzielin błon śluzowych (siara, ślina, zawartość oskrzeli itp.). Odgrywają rolę w ochronie błon śluzowych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego przed mikroorganizmami. Pod względem masy cząsteczkowej i szybkości sedymentacji podczas ultrawirowania są one zbliżone do IgG.

Za reakcje alergiczne odpowiedzialne są immunoglobuliny E (IgE) lub odczynniki (patrz rozdział 13). Odgrywają rolę w rozwoju odporności miejscowej.

Immunoglobuliny D (IgD). Występuje w niewielkich ilościach w surowicy. Nie dość studiowany.

Struktura immunoglobulin. Cząsteczki immunoglobulin wszystkich klas zbudowane są w ten sam sposób. Cząsteczki IgG mają najprostszą budowę: dwie pary łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniem dwusiarczkowym (ryc. 31). Każda para składa się z łańcucha lekkiego i ciężkiego, różniących się masą cząsteczkową. Każdy łańcuch ma miejsca stałe, które są genetycznie określone, oraz zmienne, które powstają pod wpływem antygenu. Te specyficzne regiony przeciwciała nazywane są miejscami aktywnymi. Oddziałują z antygenem, który spowodował powstanie przeciwciał. Liczba miejsc aktywnych w cząsteczce przeciwciała określa wartościowość – liczbę cząsteczek antygenu, z którymi może się związać przeciwciało. IgG i IgA są dwuwartościowe, IgM są pięciowartościowe.

Immunogeneza- powstawanie przeciwciał zależy od dawki, częstotliwości i sposobu podawania antygenu. Wyróżnia się dwie fazy pierwotnej odpowiedzi immunologicznej na antygen: indukcyjną – od momentu wprowadzenia antygenu do pojawienia się komórek tworzących przeciwciała (do 20 godzin) i produktywną, która rozpoczyna się pod koniec pierwszego dnia po wprowadzenie antygenu i charakteryzuje się pojawieniem się przeciwciał w surowicy krwi. Ilość przeciwciał stopniowo wzrasta (do 4. dnia), osiągając maksimum w 7-10. dniu i zmniejszając się pod koniec pierwszego miesiąca.

Po ponownym wprowadzeniu antygenu rozwija się wtórna odpowiedź immunologiczna. Jednocześnie faza indukcyjna jest znacznie krótsza – przeciwciała powstają szybciej i intensywniej.

Pytania kontrolne

1. Czym są przeciwciała?

2. Jakie znasz klasy immunoglobulin?

Komórkowe mechanizmy odpowiedzi immunologicznej

Komórki limfoidalne organizmu pełnią główną funkcję w rozwoju odporności - odporności nie tylko w stosunku do mikroorganizmów, ale także do wszystkich komórek obcych genetycznie, na przykład podczas przeszczepiania tkanek. Komórki limfoidalne mają zdolność odróżniania „własnego” od „obcego” i eliminowania „obcego” (eliminowania).

Przodkiem wszystkich komórek układu odpornościowego jest hematopoetyczna komórka macierzysta. W przyszłości rozwijają się dwa typy limfocytów: T i B (zależne od grasicy i zależne od kaletki). Nazwy tych komórek pochodzą od ich pochodzenia. Limfocyty T rozwijają się w grasicy (wolu lub grasicy) oraz pod wpływem substancji wydzielanych przez grasicę w obwodowej tkance limfatycznej.

Nazwa limfocyty B (zależne od torebki) pochodzi od słowa „bursa” – torba. W kaletce Fabriciusa ptaki rozwijają komórki podobne do ludzkich limfocytów B. Chociaż u ludzi nie znaleziono żadnego organu analogicznego do Worka Fabriciusa, nazwa ta jest kojarzona z tą torbą.

Podczas rozwoju limfocytów B z komórki macierzystej przechodzą one przez kilka etapów i przekształcają się w limfocyty zdolne do tworzenia komórek plazmatycznych. Komórki plazmatyczne tworzą z kolei przeciwciała, a na ich powierzchni znajdują się trzy klasy immunoglobulin: IgG, IgM i IgA (ryc. 32).

Odpowiedź immunologiczna w postaci wytwarzania swoistych przeciwciał przebiega w następujący sposób: obcy antygen, przedostając się do organizmu, ulega przede wszystkim fagocytozie przez makrofagi. Makrofagi, przetwarzając i koncentrując antygen na swojej powierzchni, przekazują o nim informację komórkom T, które zaczynają się dzielić, „dojrzewać” i wydzielać czynnik humoralny, który obejmuje limfocyty B do produkcji przeciwciał. Te ostatnie również „dojrzewają”, rozwijają się w komórki plazmatyczne, które syntetyzują przeciwciała o danej swoistości.

Tak więc, dzięki wspólnym wysiłkom, makrofagi, limfocyty T i B pełnią funkcje odpornościowe organizmu - ochronę przed wszystkim, co jest genetycznie obce, w tym patogenami chorób zakaźnych. Ochrona przeciwciałami odbywa się w ten sposób, że immunoglobuliny syntetyzowane z danym antygenem, łącząc się z nim (antygenem), przygotowują go, uwrażliwiają na zniszczenie, neutralizację poprzez różne naturalne mechanizmy: fagocyty, dopełniacz itp.

Pytania kontrolne

1. Jaka jest rola makrofagów w odpowiedzi immunologicznej?

2. Jaka jest rola limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej?

3. Jaka jest rola limfocytów B w odpowiedzi immunologicznej?

Teorie odporności. Znaczenie przeciwciał w rozwoju odporności jest niezaprzeczalne. Jaki jest mechanizm ich powstawania? Sprawa ta od dawna jest przedmiotem kontrowersji i dyskusji.

Powstało kilka teorii powstawania przeciwciał, które można podzielić na dwie grupy: selektywną (selekcja – selekcja) i instruktażową (instruowanie – instruowanie, bezpośrednie).

Teorie selektywne sugerują istnienie w organizmie gotowych przeciwciał przeciwko każdemu antygenowi lub komórkom zdolnym do syntezy tych przeciwciał.

Zatem Ehrlich (1898) zasugerował, że komórka ma gotowe „receptory” (przeciwciała), które są połączone z antygenem. Po połączeniu z antygenem przeciwciała powstają w jeszcze większej ilości.

Tę samą opinię podzielali twórcy innych teorii selektywnych: N. Jerne (1955) i F. Burnet (1957). Argumentowali, że już w ciele płodu, a następnie w organizmie dorosłego człowieka znajdują się komórki zdolne do interakcji z dowolnym antygenem, jednak pod wpływem określonych antygenów pewne komórki wytwarzają „niezbędne” przeciwciała.

Pouczające teorie [F. Gaurowitz, L. Pauling, K. Landsteiner, 1937-1940] uważają antygen za „matrycę”, stempel, na którym tworzą się określone grupy cząsteczek przeciwciał.

Teorie te nie wyjaśniały jednak wszystkich zjawisk odporności, a obecnie najbardziej akceptowaną jest teoria selekcji klonalnej F. Burneta (1964). Zgodnie z tą teorią, w okresie embrionalnym w ciele płodu znajduje się wiele limfocytów – komórek progenitorowych, które ulegają zniszczeniu, gdy napotkają własne antygeny. Dlatego w dorosłym organizmie nie ma już komórek wytwarzających przeciwciała przeciwko własnym antygenom. Kiedy jednak dorosły organizm napotka obcy antygen, następuje selekcja (selekcja) klonu komórek immunologicznie aktywnych, które wytwarzają swoiste przeciwciała skierowane przeciwko temu „obcemu” antygenowi. Przy ponownym spotkaniu z tym antygenem komórki „wybranego” klonu są już większe i szybciej tworzą więcej przeciwciał. Teoria ta najpełniej wyjaśnia podstawowe zjawiska odporności.

Mechanizm oddziaływania antygenu i przeciwciał ma różne wyjaśnienia. Zatem Ehrlich porównał ich związek do reakcji mocnego kwasu i mocnej zasady, prowadzącej do powstania nowej substancji, takiej jak sól.

Borde uważał, że antygen i przeciwciała adsorbują się wzajemnie jak farba i bibuła filtracyjna lub jod i skrobia. Jednak teorie te nie wyjaśniały najważniejszej rzeczy - specyfiki reakcji immunologicznych.

Najbardziej kompletny mechanizm łączenia antygenu i przeciwciała wyjaśnia hipoteza Marreka (teoria „kraty”) i Paulinga (teoria „farmy”) (ryc. 33). Marrek rozważa połączenie antygenu i przeciwciał w postaci siatki, w której antygen występuje naprzemiennie z przeciwciałem, tworząc konglomeraty sieci. Zgodnie z hipotezą Paulinga (patrz ryc. 33) przeciwciała mają dwie wartościowości (dwie specyficzne determinanty), a antygen ma kilka wartościowości – jest wielowartościowy. Po połączeniu antygenu i przeciwciał powstają aglomeraty przypominające budynki „gospodarskie”.

Przy optymalnym stosunku antygenu i przeciwciał tworzą się duże, silne kompleksy, które są widoczne gołym okiem. Przy nadmiarze antygenu każde centrum aktywne przeciwciał zostaje wypełnione cząsteczką antygenu, przeciwciał jest za mało, aby połączyć się z innymi cząsteczkami antygenu i tworzą się małe, niewidoczne kompleksy. Przy nadmiarze przeciwciał nie ma wystarczającej ilości antygenu, aby utworzyć siatkę, nie ma determinantów przeciwciał i nie ma widocznych objawów reakcji.

W oparciu o powyższe teorie specyficzność reakcji antygen-przeciwciało jest dziś przedstawiana jako oddziaływanie grupy determinantowej antygenu i centrów aktywnych przeciwciała. Ponieważ przeciwciała powstają pod wpływem antygenu, ich struktura odpowiada grupom determinującym antygen. Grupa determinacyjna antygenu i fragmenty miejsc aktywnych przeciwciała mają przeciwne ładunki elektryczne i po połączeniu tworzą kompleks, którego siła zależy od stosunku składników i środowiska, w którym oddziałują.

Doktryna odporności – immunologia – odniosła ogromny sukces w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Ujawnienie wzorców procesu odpornościowego umożliwiło rozwiązanie różnych problemów w wielu dziedzinach medycyny. Opracowano i udoskonalono metody zapobiegania wielu chorobom zakaźnym; leczenie chorób zakaźnych i wielu innych (autoimmunologicznych, niedoborów odporności); zapobieganie śmierci płodu w sytuacjach konfliktu Rh; przeszczepianie tkanek i narządów; walka z nowotworami złośliwymi; immunodiagnostyka - wykorzystanie reakcji odpornościowych do celów diagnostycznych.

Reakcje immunologiczne to reakcje pomiędzy antygenem a przeciwciałem lub pomiędzy antygenem a uwrażliwionymi* limfocytami, które zachodzą w żywym organizmie i mogą zostać odtworzone w laboratorium.

* (Uwrażliwiony - nadwrażliwy.)

Reakcje odpornościowe weszły do ​​praktyki diagnozowania chorób zakaźnych na przełomie XIX i XX wieku. Ze względu na dużą czułość (wychwytują antygeny w bardzo dużych rozcieńczeniach) i, co najważniejsze, ścisłą swoistość (pozwalają na rozróżnienie antygenów o podobnym składzie), znalazły szerokie zastosowanie w rozwiązywaniu teoretycznych i praktycznych problemów medycyny i biologia. Z reakcji tych korzystają immunolodzy, mikrobiolodzy, specjaliści chorób zakaźnych, biochemicy, genetycy, biolodzy molekularni, onkolodzy eksperymentalni i lekarze innych specjalności.

Reakcje antygen-przeciwciało nazywane są serologicznymi (od łac. surowica - surowica) lub humoralnymi (od łac. humor - płyn), ponieważ biorące udział w nich przeciwciała (immunoglobuliny) zawsze znajdują się w surowicy krwi.

Reakcje antygenowe z uwrażliwionymi limfocytami nazywane są komórkowymi.

Pytania kontrolne

1. Jak powstają przeciwciała?

2. Jakie znasz teorie powstawania przeciwciał?

3. Jaki jest mechanizm interakcji antygen-przeciwciało?

Reakcje serologiczne

Reakcje serologiczne - reakcje interakcji antygenu z przeciwciałem przebiegają dwuetapowo: I faza - specyficzna - utworzenie kompleksu antygenu i odpowiadającego mu przeciwciała (patrz ryc. 33). W tej fazie nie ma widocznych zmian, ale powstały kompleks staje się wrażliwy na niespecyficzne czynniki środowiska (elektrolity, dopełniacz, fagocyty); II faza – niespecyficzna. W tej fazie swoisty kompleks antygen-przeciwciało oddziałuje z nieswoistymi czynnikami środowiska, w którym zachodzi reakcja. Efekt ich interakcji widać gołym okiem (sklejenie, rozpuszczenie itp.). Czasami te widoczne zmiany są nieobecne.

Charakter widocznej fazy reakcji serologicznych zależy od stanu antygenu i warunków środowiskowych, w jakich oddziałuje on z przeciwciałem. Występują reakcje aglutynacji, wytrącania, lizy immunologicznej, wiązania dopełniacza itp. (Tabela 14).

Zastosowanie testów serologicznych. Jednym z głównych zastosowań reakcji serologicznych jest laboratoryjna diagnostyka zakażeń. Służą do: 1) wykrywania przeciwciał w surowicy pacjenta, czyli do serodiagnostyki; 2) określenie rodzaju lub rodzaju antygenu, np. wyizolowanego z chorego mikroorganizmu, czyli jego identyfikacja.

W tym przypadku nieznany składnik jest określany przez znany. Na przykład, aby wykryć przeciwciała w surowicy pacjenta, pobiera się znaną hodowlę laboratoryjną mikroorganizmu (antygen). Jeśli surowica z nią reaguje, to zawiera odpowiednie przeciwciała i można sądzić, że ten drobnoustrój jest przyczyną choroby u badanego pacjenta.

W przypadku konieczności ustalenia, który drobnoustrój jest izolowany, bada się go w reakcji ze znaną surowicą diagnostyczną (immunologiczną). Dodatni wynik reakcji wskazuje, że jest to mikroorganizm identyczny z tym, którym zwierzę immunizowano w celu uzyskania surowicy (tab. 15).

Reakcje serologiczne wykorzystuje się także do określenia aktywności (miana) surowic oraz w badaniach naukowych.

Przeprowadzanie reakcji serologicznych wymaga specjalnego przygotowania.

Naczynia do reakcji serologicznych muszą być czyste i suche. Stosuje się probówki (bakteriologiczne, aglutynacyjne, wytrącające i wirówkowe), pipety miarowe o różnych rozmiarach i Pasteura*, kolby, cylindry, szkiełka i szkiełka nakrywkowe, szalki Petriego, plastikowe płytki z otworami.

* (Każdy składnik reakcji dozowany jest oddzielną pipetą. Pipety należy zachować do końca doświadczenia. W tym celu wygodnie jest umieścić je w sterylnych probówkach z zaznaczonym miejscem, w którym znajduje się pipeta.)

Narzędzia i wyposażenie: pętla, statywy, szkło powiększające, aglutynoskop, termostat, lodówka, wirówka, waga chemiczna z odważnikiem.

Materiały: przeciwciała (surowice odpornościowe i testowe), antygeny (hodowle mikroorganizmów, materiały diagnostyczne, ekstrakty, lizaty, hapteny, erytrocyty, toksyny), dopełniacz, izotoniczny roztwór chlorku sodu.

Uwaga! W reakcjach serologicznych stosuje się wyłącznie chemicznie czysty chlorek sodu.

Sera. Surowica pacjenta. Surowicę pobiera się zwykle w drugim tygodniu choroby, kiedy można się w niej spodziewać przeciwciał, czasami wykorzystuje się surowice rekonwalescentów (w trakcie rekonwalescencji) i osób po przebytych chorobach.

Najczęściej w celu uzyskania surowicy pobiera się krew z żyły w ilości 3-5 ml do jałowej probówki i wysyła do laboratorium wraz z etykietą zawierającą nazwisko i inicjały pacjenta, rzekomą diagnozę oraz datę.

Krew należy pobierać na czczo lub nie wcześniej niż 6 godzin po posiłku. Surowica krwi po jedzeniu może zawierać kropelki tłuszczu, przez co jest mętna i nienadająca się do badań (taka surowica nazywa się chylous).

Uwaga! Podczas pobierania krwi należy przestrzegać zasad aseptyki.

Aby uzyskać surowicę, krew pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub umieszcza w termostacie o temperaturze 37°C na 30 minut w celu wytworzenia skrzepu.

Uwaga! Surowicy nie należy przechowywać w termostacie dłużej niż 30 minut – może wystąpić hemoliza, co zakłóci badanie.

Powstały skrzep oddziela się od ścianek probówki za pomocą pipety Pasteura lub pętli („koła”). Probówkę umieszcza się na pewien czas w lodówce (zwykle na 1 godzinę, ale nie dłużej niż 48 godzin), aby lepiej oddzielić surowicę od skrzepu, który skurczył się na zimno. Następnie surowicę aspiruje się sterylną pipetą Pasteura wyposażoną w gumowy balon lub wąż.

Surowicę należy odsysać bardzo ostrożnie, aby nie złapać powstałych elementów. Surowica powinna być całkowicie przezroczysta, bez domieszki komórek. Mętne surowice są ponownie odsysane po opadnięciu komórek. Surowicę można uwolnić od utworzonych elementów poprzez wirowanie.

Uwaga! Surowica może pozostać na skrzepie nie dłużej niż 48 godzin w temperaturze + 4 ° C.

Aby uzyskać surowicę, można pobrać krew z nakłucia miazgi palca lub płatka ucha za pomocą pipety Pasteura. U niemowląt krew pobierana jest z nacięcia w pięcie w kształcie litery U.

Podczas używania pipety Pasteura krew z nakłucia jest zasysana do pipety. Ostry koniec pipety jest uszczelniony. Pipetę umieszcza się w probówce ostrym końcem w dół. Aby się nie stłukła, na dno probówki umieszcza się kawałek waty. Odpowiednio oznakowana probówka wysyłana jest do laboratorium. Surowica zgromadzona na szerokim końcu pipety jest odsysana.

Surowice odpornościowe uzyskuje się z krwi ludzi lub zwierząt (najczęściej królików i koni) uodpornionych według określonego schematu odpowiednim antygenem (szczepionką). W powstałej surowicy określa się jej aktywność (miano), tj. największe rozcieńczenie, w którym reaguje ona z odpowiednim antygenem w określonych warunkach doświadczalnych.

Serwatka jest zwykle przygotowywana w produkcji. Wlewa się je do ampułek, które wskazują nazwę i tytuł. W większości przypadków surowice są suszone. Przed użyciem suchą serwatkę rozpuszcza się w wodzie destylowanej do pierwotnej objętości (również wskazanej na etykiecie). Wszystkie suche (liofilizowane) preparaty diagnostyczne przechowywać w temperaturze 4-10°C.

Do badań serologicznych wykorzystuje się natywne (nieadsorbowane) i adsorbowane surowice odpornościowe. Wadą surowic natywnych jest obecność w nich przeciwciał grupowych, czyli przeciwciał przeciwko mikroorganizmom posiadającym wspólne antygeny. Zazwyczaj takie antygeny znajdują się w drobnoustrojach należących do tej samej grupy, rodzaju, rodziny. Zaadsorbowane surowice są wysoce specyficzne: reagują jedynie z antygenem homologicznym. Przeciwciała skierowane przeciwko innym (heterogennym) antygenom są usuwane poprzez adsorpcję. Miano przeciwciał w zaadsorbowanych surowicach jest niskie (1:40, 1:320), dlatego nie są one rozcieńczane*.

* (Obecnie na drodze biotechnologii uzyskano specjalne komórki (hybrydomy), które wytwarzają in vitro przeciwciała monoklonalne, czyli przeciwciała reagujące ściśle specyficznie (z jednym antygenem).)

Reakcja aglutynacji

Reakcja aglutynacji (RA) to aglutynacja i wytrącanie drobnoustrojów lub innych komórek pod wpływem przeciwciał w obecności elektrolitu (izotoniczny roztwór chlorku sodu). Powstały osad nazywa się aglutynianem. Do reakcji potrzebujesz:

1. Przeciwciała (aglutyniny) – znajdują się w surowicy pacjenta lub surowicy odpornościowej.

2. Antygen – zawiesina żywych lub zabitych mikroorganizmów, erytrocytów lub innych komórek.

3. Roztwór izotoniczny.

Reakcja aglutynacji w diagnostyce serologicznej jest szeroko stosowana w przypadku duru brzusznego, duru brzusznego (reakcja Vidala), brucelozy (reakcja Wrighta) itp. W tym przypadku surowica pacjenta jest przeciwciałem, a znany drobnoustrój jest antygenem.

Po zidentyfikowaniu drobnoustrojów lub innych komórek ich zawiesina służy jako antygen, a znana surowica odpornościowa służy jako przeciwciało. Reakcja ta jest szeroko stosowana w diagnostyce infekcji jelitowych, krztuśca itp.

Przygotowanie składników: 1) otrzymanie surowicy, patrz s. 200; 2) przygotowanie antygenu. Zawiesina żywych drobnoustrojów powinna być jednorodna i odpowiadać (w 1 ml) około 30 jednostkom. zmętnienie zgodnie ze standardem optycznym GISK. Do jego przygotowania wykorzystuje się zwykle hodowlę 24-godzinną hodowaną na skosie agarowym. Hodowlę zmywa się 3-4 ml roztworu izotonicznego, przenosi do sterylnej probówki, określa jej gęstość i w razie potrzeby rozcieńcza.

Zastosowanie zawiesiny zabitych drobnoustrojów – Diagnostyka – ułatwia pracę i czyni ją bezpieczną. Zwykle korzystają z diagnostyki przygotowanej fabrycznie.

Ustawienie reakcji. Istnieją dwie metody przeprowadzenia tej reakcji: reakcja aglutynacji na szkle (czasami nazywana aglutynacją przybliżoną) i reakcja aglutynacji przedłużonej (w probówkach).

Reakcja aglutynacji na szkle. Na beztłuszczowe szkiełko szklane nanosi się 2 krople specyficznej (adsorbowanej) surowicy i kroplę roztworu izotonicznego. Surowice niezaadsorbowane są wstępnie rozcieńczane w stosunku 1:5 - 1:25. Krople nakłada się na szybę tak, aby zachować między nimi odległość. Za pomocą woskowego ołówka na szkle zaznaczają, gdzie jest która kropla. Hodowlę ostrożnie rozciera się ezą lub pipetą o szklankę, a następnie dodaje do kropli roztworu izotonicznego i jednej z kropli surowicy, mieszając aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Kontrolą surowicy jest kropla surowicy bez hodowli.

Uwaga! Hodowli surowicy nie należy przenosić do kropli izotonicznej soli fizjologicznej, która stanowi kontrolę antygenową.

Reakcja przebiega w temperaturze pokojowej przez 1–3 minuty. Kontrola surowicy powinna pozostać przejrzysta, a w kontroli antygenu powinno być widoczne jednolite zmętnienie. Jeżeli na tle klarownej cieczy w kropli, w której kultura zostanie zmieszana z surowicą, pojawią się płatki aglutynatu, wynik reakcji uważa się za pozytywny. Jeśli wynik reakcji będzie ujemny, kropla będzie miała równomierne zmętnienie, jak w przypadku kontroli antygenowej.

Reakcja jest wyraźniej widoczna, gdy patrzy się na ciemne tło w świetle przechodzącym. Studiując go, możesz użyć szkła powiększającego.

Przedłużona reakcja aglutynacji. Przygotowuje się sekwencyjne, najczęściej dwukrotne rozcieńczenia surowicy. Surowicę pacjenta rozcieńcza się zwykle w stosunku od 1:50 do 1:1600, immunologiczną do miana lub do połowy miana. Miano surowicy aglutynującej to jej maksymalne rozcieńczenie, w którym aglutynuje ona komórki homologiczne.

Rozcieńczanie surowicy: 1) umieścić na stojaku wymaganą liczbę probówek o tej samej średnicy, wysokości i konfiguracji dna;

2) na każdej probówce wskazać stopień rozcieńczenia surowicy, dodatkowo na pierwszej probówce wpisać numer doświadczenia lub nazwę antygenu. Na probówkach kontroli napisz „KS” – kontrola surowicy i „KA” – kontrola antygenu;

3) do wszystkich probówek wlać 1 ml roztworu izotonicznego;

4) przygotować wstępne (robocze) rozcieńczenie surowicy w osobnej probówce. Na przykład, aby przygotować robocze rozcieńczenie 1:50, do probówki wlewa się 4,9 ml roztworu izotonicznego i 0,1 ml surowicy. Stopień jego rozcieńczenia należy wskazać na probówce. Początkowe rozcieńczenie surowicy dodaje się do pierwszych dwóch probówek i probówki z kontrolą surowicy;

5) przygotować seryjne dwukrotne rozcieńczenia surowicy.

Przybliżony schemat jego hodowli podano w tabeli. 16.

Notatka. Strzałki wskazują transfer cieczy z probówki do probówki; z piątej probówki i probówki kontrolnej surowicy do roztworu środka dezynfekującego wlewa się 1,0 ml.

Uwaga! Wszystkie probówki muszą zawierać tę samą objętość cieczy.

Po rozcieńczeniu surowicy do wszystkich probówek z wyjątkiem kontrolnej surowicy dodaje się 1-2 krople antygenu (diagnosticum lub świeżo przygotowana zawiesina bakterii). W probówkach powinno pojawić się niewielkie, jednolite zmętnienie. Kontrola surowicy pozostaje przezroczysta.

Probówki dokładnie wytrząsa się i umieszcza w termostacie (37°C). Wstępne rozliczenie wyników reakcji przeprowadza się po 2 godzinach, a końcowe po 18-20 godzinach (utrzymując w temperaturze pokojowej).

Rozliczanie wyników, jak zawsze, zaczyna się od kontroli. Kontrola surowicy powinna pozostać klarowna, kontrola antygenowa jednolicie mętna. Probówki ogląda się w świetle przechodzącym (bardzo wygodne na ciemnym tle) gołym okiem, za pomocą szkła powiększającego lub aglutynoskopu.

Aglutynoskop- urządzenie składające się z wydrążonej metalowej rurki zamontowanej na stojaku. Na górze znajduje się okular ze śrubą regulacyjną. Pod tubusem zamocowane jest obrotowe lusterko. Probówkę z badaną cieczą wkłada się z boku do otworu probówki na taką odległość, aby znajdująca się w niej ciecz znalazła się pod okularem. Ustawiając oświetlenie lustrem i ogniskując okular określa się obecność i charakter aglutynatu.

W przypadku pozytywnego wyniku reakcji w probówkach widoczne są ziarna lub płatki aglutynatu. Aglutynat stopniowo osiada na dnie w postaci „parasolki”, a ciecz nad osadem staje się klarowna (porównaj z jednolicie mętną kontrolą antygenową).

Aby zbadać wielkość i charakter osadu, zawartość probówek lekko wstrząsa się. Występują aglutynacje drobnoziarniste i łuszczące się. Drobnoziarniste (O-aglutynacja) uzyskuje się podczas pracy z O-surowicą*. Łuszczący się (H) - w interakcji ruchliwych mikroorganizmów z wiciowatymi surowicami H.

* (Surowica O zawiera przeciwciała przeciwko antygenowi O (somatycznemu), surowica H - przeciwko wici.)

Aglutynacja kłaczkowata zachodzi szybciej, a powstały osad jest bardzo luźny i łatwo pęka.

Wszystkie komórki osiadły, ciecz w probówce jest całkowicie przezroczysta. Wynik reakcji jest zdecydowanie pozytywny.

Osad jest mniejszy, nie ma całkowitego oświecenia cieczy. Wynik reakcji jest pozytywny.

Osadu jest jeszcze mniej, ciecz jest mętna. Wynik reakcji jest lekko pozytywny.

Niewielki osad, mętna ciecz. Wątpliwa odpowiedź.

Nie ma osadu, ciecz jest równomiernie mętna, jak przy kontroli antygenowej. Negatywny wynik reakcji.

Możliwe błędy w formułowaniu reakcji aglutynacji. 1. Spontaniczna (spontaniczna) aglutynacja. Niektóre komórki, zwłaszcza drobnoustroje w formie R, nie dają jednorodnej (jednorodnej) zawiesiny, szybko się wytrącają. Aby tego uniknąć, należy zastosować kulturę w formie S, która nie ulega samoistnej aglutynacji.

2. W surowicy osób zdrowych występują przeciwciała przeciwko niektórym mikroorganizmom (tzw. „przeciwciała normalne”). Ich miano jest niskie. Zatem pozytywny wynik reakcji w rozcieńczeniu 1:100 i większym wskazuje na jej specyficzność.

3. Reakcja grupowa z drobnoustrojami o podobnej strukturze antygenowej. Na przykład surowica pacjenta chorego na dur brzuszny może również aglutynować bakterie paratyfusu A i B. W przeciwieństwie do specyficznej reakcji grupowej występuje ona w niższych mianach. Zaadsorbowane surowice nie dają reakcji grupowej.

4. Należy wziąć pod uwagę, że specyficzne przeciwciała po przebytej chorobie, a nawet po szczepieniach, mogą utrzymywać się przez długi czas. Nazywa się je „anamnestycznymi”. Aby odróżnić je od przeciwciał „zakaźnych” powstałych w trakcie aktualnej choroby, reakcję poddaje się dynamice, czyli bada się surowicę pacjenta, którą pobiera się ponownie po 5-7 dniach. Wzrost miana przeciwciał wskazuje na obecność choroby – miano przeciwciał „anamnestycznych” nie wzrasta, a nawet może się zmniejszyć.

Pytania kontrolne

1. Czym są reakcje immunologiczne i jakie są ich główne właściwości?

2. Jakie składniki biorą udział w reakcjach serologicznych? Dlaczego reakcje nazywane są serologicznymi, z ilu faz się składają?

3. Co to jest reakcja aglutynacji? Jego zastosowanie i metody. Co to jest diagnostyka?

4. Jaki antygen wykorzystuje się w badaniu surowicy pacjenta? Jaka surowica określa typ nieznanego drobnoustroju?

5. Co to jest aglutynacja O i H? W jakich przypadkach tworzy się kłaczkowaty osad, a kiedy drobnoziarnisty?

Ćwiczenia

1. Zaplanuj szczegółowy test aglutynacji, aby określić miano przeciwciał w surowicy pacjenta i uwzględnij jego wynik.

2. Na szkle nanieść reakcję aglutynacji w celu określenia rodzaju wyizolowanego mikroorganizmu.

Reakcja hemaglutynacji

W praktyce laboratoryjnej stosuje się dwie reakcje hemaglutynacji (RHA), różniące się mechanizmem działania.

Najpierw RGA odnosi się do serologii. W tej reakcji erytrocyty ulegają aglutynacji podczas interakcji z odpowiednimi przeciwciałami (hemaglutyninami). Reakcja jest szeroko stosowana do oznaczania grup krwi.

Drugie RGA nie jest serologiczny. W nim sklejanie czerwonych krwinek jest spowodowane nie przez przeciwciała, ale przez specjalne substancje utworzone przez wirusy. Na przykład wirus grypy aglutynuje erytrocyty kur i świnek morskich, wirus polio aglutynuje erytrocyty owiec. Reakcja ta umożliwia ocenę obecności konkretnego wirusa w materiale testowym.

Ustawienie reakcji. Reakcję umieszcza się w probówkach lub na specjalnych płytkach ze studzienkami. Materiał przeznaczony do badania na obecność wirusa rozcieńcza się roztworem izotonicznym od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml każdego rozcieńczenia miesza się z równą objętością 1-2% zawiesiny erytrocytów. W kontroli 0,5 ml erytrocytów zmieszano z 0,5 ml roztworu izotonicznego. Probówki umieszcza się w termostacie na 30 minut, a płytki pozostawia się w temperaturze pokojowej na 45 minut.

Rozliczanie wyników. W przypadku pozytywnego wyniku reakcji na dnie probówki lub dołka opada osad erytrocytów z ząbkowanymi krawędziami („parasol”), pokrywając całe dno dołka. Przy wyniku ujemnym erytrocyty tworzą gęsty osad o gładkich krawędziach („przycisk”). Ten sam osad powinien być pod kontrolą. Intensywność reakcji wyraża się znakami plus. Miano wirusa to maksymalne rozcieńczenie materiału, w którym zachodzi aglutynacja.

Reakcja hamowania hemaglutynacji

Jest to reakcja serologiczna, w której specyficzne przeciwciała przeciwwirusowe, oddziałując z wirusem (antygenem), neutralizują go i pozbawiają zdolności do aglutynacji czerwonych krwinek, czyli hamują reakcję hemaglutynacji. Wysoka specyficzność reakcji hamowania hemaglutynacji (HITA) pozwala na jej wykorzystanie do określenia rodzaju, a nawet rodzaju wirusów wykrytych podczas HA.

Ustawienie reakcji. 0,25 ml surowicy przeciwwirusowej w kolejnych dwukrotnych rozcieńczeniach od 1:10 do 1:2560 miesza się z równą objętością materiału zawierającego wirusa, rozcieńczonego 4 razy mniej niż miano ustalone w RGA. Mieszaninę wytrząsa się i umieszcza w termostacie na 30 minut, po czym dodaje się 0,5 ml 1-2% zawiesiny erytrocytów.

Po reakcji następują trzy kontrole (Tabela 17).

Wyniki rejestruje się po wielokrotnej inkubacji w termostacie przez 30 lub 45 minut w temperaturze pokojowej. Przy prawidłowym ustawieniu eksperymentu w kontroli surowicy i erytrocytów powinien powstać „przycisk” - nie ma czynnika aglutynującego erytrocyty; w kontroli antygenu tworzy się „parasol” – wirus powoduje aglutynację erytrocytów.

W eksperymencie, jeśli surowica jest homologiczna z badanym wirusem, tworzy się „przycisk” – surowica neutralizuje wirusa. Miano surowicy to jej maksymalne rozcieńczenie, w którym następuje opóźnienie hemaglutynacji.

Pośrednia reakcja hemaglutynacji

Reakcja pośredniej (biernej) hemaglutynacji (RIHA) polega na tym, że erytrocyty, jeśli na ich powierzchni zaadsorbowany zostanie rozpuszczalny antygen, nabywają zdolność do aglutynacji podczas interakcji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko zaadsorbowanemu antygenowi. Schemat RNGA pokazano na ryc. 34. RNHA jest szeroko stosowany w diagnostyce szeregu infekcji.

Ustawienie reakcji. Surowicę testową podgrzewa się przez 30 minut w temperaturze 56°C, rozcieńcza kolejno w stosunku 1:10 – 1:1280 i wlewa do probówek lub studzienek po 0,25 ml, po czym dodaje się 2 krople erytrocytów diagnostycznych (erytrocyty z antygenem na nich adsorbowane).

Kontrole: zawiesina diagnostyki erytrocytów z surowicą odpornościową; zawieszenie diagnostyki w normalnej surowicy; zawiesina prawidłowych erytrocytów z badaną surowicą. W pierwszej kontroli powinna nastąpić aglutynacja, w drugiej i trzeciej nie powinna.

Za pomocą RIGA możliwe jest oznaczenie nieznanego antygenu, jeśli znane przeciwciała są zaadsorbowane na erytrocytach.

Reakcję hemaglutynacji można ustawić w objętości 0,025 ml (mikrometoda) przy użyciu mikrotitra Takachi.

Pytania kontrolne

1. O czym świadczy dodatni wynik RGA pomiędzy erytrocytami a materiałem badanym na obecność wirusa?

2. Czy nastąpi aglutynacja erytrocytów, jeśli doda się do nich wirusa i odpowiednią surowicę? Jak nazywa się reakcja, która ujawnia to zjawisko?

Ćwiczenia

Rozważ i zarejestruj wynik Rygi.

Reakcja wytrącania

W reakcji strącania wytrąca się specyficzny kompleks immunologiczny, składający się z rozpuszczalnego antygenu (lizat, ekstrakt, hapten) i swoistego przeciwciała w obecności elektrolitów.

Mętny pierścień lub osad powstały w wyniku tej reakcji nazywany jest osadem. Reakcja ta różni się od reakcji aglutynacji głównie wielkością cząstek antygenu.

Reakcję strącania stosuje się zwykle do określenia antygenu w diagnostyce szeregu infekcji (wąglik, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych itp.); w medycynie sądowej – w celu określenia gatunku krwi, nasienia itp.; w badaniach sanitarno-higienicznych – przy stwierdzeniu fałszerstwa produktów; za jego pomocą określić pokrewieństwo filogenetyczne zwierząt i roślin. Do reakcji potrzebujesz:

1. Przeciwciała (precypityny) – surowica odpornościowa o wysokim mianie przeciwciał (nie niższym niż 1:100 000). Miano surowicy wytrącającej się określa się na podstawie największego rozcieńczenia antygenu, z którym reaguje. Surowicę najczęściej stosuje się w postaci nierozcieńczonej lub rozcieńczonej w stosunku 1:5 – 1:10.

2. Antygen – rozpuszczone substancje o charakterze polisacharydów białkowych lub lipidowych (antygeny kompletne i hapten).

3. Roztwór izotoniczny.

Głównymi metodami prowadzenia reakcji wytrącania są: reakcja wytrącania pierścieniowego i reakcja wytrącania na agarze (żelu).

Uwaga! Wszystkie składniki biorące udział w reakcji wytrącania muszą być całkowicie przezroczyste.

Reakcja wytrącania pierścienia. Do probówki do strącania za pomocą pipety Pasteura dodaje się 0,2-0,3 ml (5-6 kropli) surowicy (surowica nie powinna spadać na ścianki probówki). Antygen ostrożnie nanosi się na surowicę w tej samej objętości, wylewając ją cienką pipetą Pasteura wzdłuż ścianki probówki. Probówkę trzyma się w pozycji pochylonej. Przy właściwym nawarstwieniu należy uzyskać wyraźną granicę pomiędzy surowicą a antygenem. Ostrożnie, aby nie wymieszać płynu, umieść probówkę na statywie. Przy pozytywnym wyniku reakcji na granicy antygenu i przeciwciała tworzy się mętny „pierścień” - osad (patrz ryc. 48).

Po reakcji następuje szereg kontroli (Tabela 18). Bardzo ważna jest kolejność wprowadzania składników reakcji do probówki. Nie można nakładać surowicy na antygen (w kontroli - na roztwór izotoniczny), ponieważ gęstość względna surowicy będzie większa, opadnie ona na dno probówki, a granica między płynami nie zostanie wykryta .

Notatka. + obecność „pierścienia”; - brak „pierścienia”.

Wyniki rejestruje się po 5-30 minutach, w niektórych przypadkach po godzinie, jak zawsze, zaczynając od kontroli. „Pierścień” w drugiej probówce wskazuje zdolność surowicy odpornościowej do wejścia w specyficzną reakcję z odpowiednim antygenem. W probówkach od 3 do 5 nie powinno być „pierścieni” - nie ma odpowiadających sobie przeciwciał i antygenów. „Pierścień” w I probówce – wynik reakcji dodatni – oznacza, że ​​badany antygen odpowiada pobranej surowicy odpornościowej, brak „pierścienia” („pierścień” tylko w II probówce) wskazuje na ich niespójność – reakcja ujemna wynik.

Reakcja wytrącania na agarze (żel). Osobliwością tej reakcji jest to, że interakcja antygenu i przeciwciała zachodzi w gęstym ośrodku, tj. w żelu. Powstały osad daje mętne pasmo na grubości ośrodka. Brak pasma wskazuje na niedopasowanie składników reakcji. Reakcja ta jest szeroko stosowana w badaniach biomedycznych, w szczególności w badaniu powstawania toksyn w czynniku wywołującym błonicę.

Pytania kontrolne

1. Jaka jest główna różnica między reakcją aglutynacji a wytrącaniem?

2. Dlaczego w reakcji wytrącania nie można używać składników mętnych?

Ćwiczenia

1. Ustaw reakcję wytrącania pierścienia i narysuj wynik.

2. Zbadaj charakter oddziaływania antygenu z przeciwciałem w reakcji wytrącania agaru, narysuj wynik (odbierz kubek od nauczyciela).

Reakcja lizy (cytoliza immunologiczna)

Liza immunologiczna to rozpad komórek pod wpływem przeciwciał z obowiązkowym udziałem dopełniacza. Do reakcji potrzebujesz:

1. Antygen – drobnoustroje, erytrocyty lub inne komórki.

2. Przeciwciało (lizyna) – surowica odpornościowa, rzadziej surowica pacjenta. Surowica bakteriolityczna zawiera przeciwciała biorące udział w lizie bakterii; hemolityczny - hemolizyny, które przyczyniają się do lizy czerwonych krwinek; do lizy krętków potrzebne są spirochetolizyny, komórki - itolizyny itp.

3. Uzupełnij. Najwięcej uzupełnień w surowicy świnek morskich. To serum (mieszanka kilku zwierząt) jest zwykle stosowane jako uzupełnienie. Świeży (natywny) dodatek jest niestabilny i łatwo ulega zniszczeniu w wyniku ogrzewania, wstrząsania, przechowywania, dlatego można go zużyć nie dłużej niż dwa dni od otrzymania. Aby zachować dopełniacz, dodaje się do niego 2% kwasu borowego i 3% siarczanu sodu. Dodatek ten można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie dwa tygodnie. Częściej stosuje się suchy dopełniacz. Przed użyciem rozpuszcza się w roztworze izotonicznym do pierwotnej objętości (wskazanej na etykiecie).

4. Roztwór izotoniczny.

Reakcja hemolizy(Tabela 19). Do reakcji potrzebujesz:

1. Antygen - 3% zawiesina przemytych erytrocytów owczych w ilości 0,3 ml osadu erytrocytów i 9,7 ml roztworu izotonicznego.

2. Przeciwciało - surowica hemolityczna (hemolizyna) przeciwko erytrocytom owczym; zwykle przygotowywany w produkcji, liofilizowany, a miano jest podane na etykiecie.

Miano hemolizyny to najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym następuje całkowita hemoliza 3% zawiesiny erytrocytów w obecności dopełniacza. W przypadku reakcji hemolizy hemolizynę pobiera się w potrójnym mianowaniu, tj. Jest ona rozcieńczana 3 razy mniej niż przed mianem. Na przykład, przy mianie surowicy wynoszącym 1:1200, surowicę rozcieńcza się w stosunku 1:400 (0,1 ml surowicy* i 39,9 ml izotonicznej soli fizjologicznej). Konieczny jest nadmiar hemolizyny, ponieważ jej część może zostać zaadsorbowana przez inne składniki reakcji.

* (Nie należy pobierać mniej niż 0,1 ml surowicy – ​​pogarsza się dokładność pomiaru.)

3. Dopełniacz rozcieńcza się w stosunku 1:10 (0,2 ml dopełniacza i 1,8 ml izotonicznej soli fizjologicznej).

4. Roztwór izotoniczny.

Rozliczanie wyników. Przy prawidłowo ustawionej reakcji w pierwszej probówce nastąpi hemoliza - jej zawartość stanie się przezroczysta. W kontrolach płyn pozostaje mętny: w drugiej probówce brakuje dopełniacza na początku hemolizy, w trzeciej probówce nie ma hemolizyny, w czwartej probówce nie ma hemolizyny ani dopełniacza, w piątej probówce, antygen nie pasuje do przeciwciała,

W razie potrzeby miareczkuje się surowicę hemolityczną według poniższego schematu (Tabela 20).

Przed miareczkowaniem przygotowuje się wstępne rozcieńczenie surowicy 1:100 (0,1 ml surowicy i 9,9 ml izotonicznej soli fizjologicznej), z którego sporządza się niezbędne rozcieńczenia, np.:

Z tych rozcieńczeń do probówek miareczkowych dodaje się 0,5 ml surowicy, jak pokazano w tabeli. 20.

W przykładzie podanym w tabeli. 20, miano surowicy hemolitycznej wynosi 1:1200.

W przypadku stosowania świeżej surowicy hemolitycznej należy ją inaktywować, aby zniszczyć jej uzupełnienie. W tym celu ogrzewa się go przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub w inaktywatorze z termostatem. Ta druga metoda jest lepsza: eliminuje możliwość przegrzania surowicy, czyli jej denaturacji. Surowice zdenaturowane nie nadają się do badania.

reakcja bakteriolizy. W tej reakcji bakterie uzupełniają się w obecności odpowiedniej (homologicznej) surowicy. Schemat reakcji jest zasadniczo podobny do schematu reakcji hemolizy. Różnica polega na tym, że po dwugodzinnej inkubacji wszystkie probówki wysiewa się na szalki Petriego z pożywką korzystną dla pobranego w doświadczeniu mikroorganizmu w celu sprawdzenia, czy uległa ona lizie. Przy prawidłowo ustawionym doświadczeniu w uprawach z probówek 2-5 (kontrola) powinien nastąpić obfity wzrost. Brak wzrostu lub słaby wzrost hodowli z pierwszej probówki (eksperyment) wskazuje na śmierć drobnoustrojów, czyli na to, że są one homologiczne z przeciwciałem.

Uwaga! Reakcję bakteriolizy należy przeprowadzić w warunkach aseptycznych.

Pytania kontrolne

1. Co stanie się z erytrocytami, jeśli zamiast izotonicznego roztworu chlorku sodu zostanie użyta woda destylowana? Co leży u podstaw tego zjawiska?

2. Jaka reakcja nastąpi w przypadku interakcji erytrocytów z homologiczną surowicą odpornościową przy braku dopełniacza?

Ćwiczenia

Ustawić reakcję hemolizy. Zapisz i narysuj wynik.

Reakcja wiązania dopełniacza

Reakcja wiązania dopełniacza (RCC) polega na tym, że specyficzny kompleks antygen-przeciwciało zawsze adsorbuje (wiąże) dopełniacz na sobie.

Reakcja ta znajduje szerokie zastosowanie w identyfikacji antygenów oraz w serodiagnostyce zakażeń, zwłaszcza chorób wywoływanych przez krętki (reakcja Wassermanna), riketsje i wirusy.

RSK to złożona reakcja serologiczna. Obejmuje dopełniacz i dwa układy antygen-przeciwciało. Zasadniczo są to dwie reakcje serologiczne.

Układ pierwszy – główny – składa się z antygenu i przeciwciała (jeden jest znany, drugi nie). Dodaje się do niego pewną ilość dopełniacza. Kiedy antygen i przeciwciało tego układu pasują, połączą się i zwiążą dopełniacz. Powstały kompleks jest drobno zdyspergowany i nie jest widoczny.

Tworzenie tego kompleksu jest znane za pomocą drugiego układu hemolitycznego lub wskaźnikowego. W jego skład wchodzą erytrocyty owiec (antygen) oraz odpowiadająca im surowica hemolityczna (przeciwciało), czyli gotowy kompleks immunologiczny. W tym systemie liza erytrocytów może nastąpić tylko w obecności dopełniacza. Jeśli dopełniacz jest związany przez pierwszy układ (jeśli antygen i przeciwciało w nim odpowiadają), wówczas w drugim układzie nie będzie hemolizy - ponieważ nie ma wolnego dopełniacza. Brak hemolizy (zawartość probówki jest mętna lub na dnie probówki znajduje się osad erytrocytów) uznaje się za wynik dodatni RSK (ryc. 35).

Jeśli antygen nie pasuje do przeciwciała w pierwszym układzie, wówczas kompleks immunologiczny nie tworzy się, a dopełniacz pozostaje wolny. Pozostając wolnym, dopełniacz bierze udział w drugim układzie, powodując hemolizę - wynik RSC jest ujemny (zawartość probówek jest przezroczysta - „krew lakieru”).

Składniki reakcji wiązania dopełniacza: 1. Antygen – zwykle lizat, ekstrakt, hapten; zawiesina mikroorganizmów Główny 2. Przeciwciało – surowica układu pacjenta 3. Dopełniacz – surowica świnek morskich 4. Antygen – erytrocyty owiec Hemolityczny – 5. Przeciwciało – hemolizyna wobec erytrocytów owiec 6. Układ roztworu izotonicznego

Ze względu na to, że w RSC bierze udział duża liczba złożonych składników, należy je wstępnie miareczkować i wprowadzić do reakcji w dokładnych ilościach i równych objętościach: 0,5 lub 0,25, rzadziej 0,2 ml. W związku z tym całe doświadczenie przeprowadza się w objętościach 2,5, 1,25 lub 1,0 ml (większe objętości dają dokładniejszy wynik). Miareczkowanie składników reakcji przeprowadza się w takiej samej objętości jak w doświadczeniu, zastępując brakujące składniki roztworem izotonicznym.

Przygotowanie składników

1. Surowica hemolityczna(hemolizyna). Surowicę rozcieńcza się 3 razy mniej niż jej miano. Przygotuj całkowite rozcieńczenie surowicy na całe doświadczenie; którego objętość określa się, mnożąc objętość surowicy w jednej probówce (na przykład 0,5 ml) przez liczbę probówek, nieznacznie przekraczając ich liczbę w doświadczeniu *.

* (Nadmiar płynu jest niezbędny do przygotowania wszystkich składników reakcji: jego część pozostaje na ściankach probówek, kolb, pipet.)

2. Erytrocyty owiec. Z całej liczby probówek objętych doświadczeniem przygotowuje się 3% zawiesinę przemytych erytrocytów owczych.

W celu przygotowania układu hemolitycznego na 30 minut przed wprowadzeniem go do doświadczenia miesza się równe objętości rozcieńczonej zawiesiny hemolizyny i erytrocytów, dodając do erytrocytów surowicę, dokładnie miesza i inkubuje przez 30 minut w temperaturze 37°C (uczulony).

3. Komplement zwykle rozcieńczany 1:10. Należy go miareczkować przed każdym doświadczeniem. Miano dopełniacza to jego najmniejsza ilość, po dodaniu do układu hemolitycznego całkowita hemoliza następuje w ciągu 1 godziny w temperaturze 37 ° C. Schemat miareczkowania dopełniacza przedstawiono w tabeli. 21.

Notatka. Całkowita objętość płynu w probówkach wynosi 2,5 ml.

Uwaga! Dopełnienie miareczkuje się w tej samej objętości, co w głównym doświadczeniu, zastępując brakujące składniki roztworem izotonicznym.

Rozliczanie wyników. W kontrolach nie powinno być nawet śladów hemolizy, ponieważ jedna z nich nie zawiera dopełniacza, a druga nie zawiera hemolizyny. Kontrole wskazują na brak reakcji hemotoksycznych (zdolność do spontanicznej lizy erytrocytów) w składnikach.

Na stole. Na przykład miano dopełniacza w rozcieńczeniu 1:10 wynosi 0,15 ml. W eksperymencie aktywność dopełniacza może się zmniejszyć ze względu na jego nieswoistą adsorpcję przez inne składniki reakcji, dlatego w eksperymencie zwiększa się ilość dopełniacza: przyjmuje się dawkę zgodnie z mianem. To jest dawka robocza. W podanym przykładzie jest to 0,2 ml dopełniacza w rozcieńczeniu 1:10. Ponieważ wszystkie składniki biorące udział w CSC należy pobrać w równych objętościach (w naszym przykładzie jest to 0:5 ml), konieczne jest dodanie 0,3 ml roztworu izotonicznego do roboczej dawki dopełniacza (0,2 ml 1:10). Dla całego doświadczenia objętość każdego z nich (uzupełniacza i roztworu izotonicznego) mnoży się przez liczbę probówek znajdujących się w CSC. Przykładowo, aby przeprowadzić doświadczenie w 50 probówkach należy pobrać 10 ml dopełniacza 1:10 (0,2 ml x 50) i 15 ml roztworu izotonicznego (0,3 ml x 50).

4. Antygen zwykle przygotowujemy go ze wskazaniem jego miana, czyli ilości, która po rozcieńczeniu antygenu powinna zawierać się w 1 ml. Na przykład przy mianie 0,4 rozcieńcza się go w 0,96 ml roztworu izotonicznego. W doświadczeniu należy przyjąć ilość antygenu równą połowie miana (0,5 ml). To jest jego dawka robocza. Przygotuj całkowite rozcieńczenie antygenu dla całego doświadczenia, mnożąc 0,5 ml przez liczbę probówek w doświadczeniu.

5. Przeciwciało- Surowica pacjenta. Przed eksperymentem świeżą surowicę inaktywuje się w celu zniszczenia zawartego w niej dopełniacza. W tym celu ogrzewa się go przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub w inaktywatorze z termostatem. Preferowana jest ta druga metoda: eliminuje możliwość przegrzania surowicy, czyli jej denaturacji. Surowice zdenaturowane nie nadają się do badania. Surowicę pacjenta stosuje się zwykle w rozcieńczeniu od 1:10 do 1:160.

Surowice odpornościowe są najczęściej przygotowywane w warunkach przemysłowych i uwalniane w postaci inaktywowanej. Są hodowane w skali 1:50 i wyższej.

Uwaga! Wszystkie składniki przygotowuje się z niewielkim nadmiarem.

Przeprowadzenie głównego doświadczenia

Przygotowując eksperyment, niezwykle ważna jest kolejność dodawania składników. Doświadczenie przeprowadza się w dwóch fazach (tabela 22).

1 (W doświadczeniu surowicę można badać w kolejnych dwukrotnych rozcieńczeniach.)

Faza I. Do probówek wlewa się wymaganą ilość izotonicznego roztworu chlorku sodu, następnie wymaganą objętość rozcieńczonej surowicy i w tej samej objętości robocze dawki antygenu i dopełniacza. Doznaniu koniecznie towarzyszy kontrola wszystkich składników biorących w nim udział: surowicy, antygenu, układu hemolitycznego i dopełniacza.

Probówki dokładnie wytrząsa się i inkubuje w temperaturze 37°C przez 45 minut - 1 godzinę lub w temperaturze 4°C („CSC na zimno”) przez 18 h. W tym czasie, w obecności określonego kompleksu, następuje wiązanie dopełniacza. Prowadzenie reakcji „na zimno” znacząco zwiększa jej czułość i swoistość.

etap II. Po zakończeniu inkubacji do wszystkich probówek, które wcześniej umieszczono w termostacie na 30 minut (uczulonych), dodaje się 1 ml układu hemolitycznego. Probówki są wstrząsane i umieszczane z powrotem w termostacie.

Rozliczanie wyników. Probówki pozostawia się w termostacie do czasu całkowitej hemolizy w probówkach 2., 3., 6. i 7. (kontrola surowicy, antygenu i dopełniacza dla jednej i dwóch dawek). Przede wszystkim w siódmej probówce, która zawiera podwójną ilość dopełniacza, nastąpi hemoliza. Po wystąpieniu hemolizy w tej probówce i jej zawartość stanie się całkowicie przezroczysta, należy uważnie monitorować pozostałe kontrole. Gdy tylko ciecz w probówkach 2., 3. i 6. stanie się przezroczysta, należy natychmiast wyjąć statyw z probówkami z termostatu. O tym, że doświadczenie nie było przetrzymywane w termostacie dłużej, niż to konieczne, świadczy obecność niewielkiego zmętnienia (niepełna hemoliza) w 5 probówce - zawiera ona tylko połowę dawki roboczej dopełniacza i pełną hemolizę przy prawidłowym ustawieniu eksperyment nie może być.

Hemoliza w kontroli surowicy i antygenu (probówki 2 i 3) wskazuje, że ich dawki zostały wybrane prawidłowo i że ani surowica, ani antygen dopełniacza nie wiążą się same.

W kontroli układu hemolitycznego (rurka 4), jeśli działa prawidłowo, nie powinno być nawet śladów hemolizy - brakuje mu dopełnienia.

Po upewnieniu się, że kontrole przebiegły prawidłowo, można wziąć pod uwagę doświadczenie. Brak hemolizy w probówkach doświadczenia uważa się za pozytywny wynik reakcji. Wskazuje, że w surowicy znajdują się przeciwciała specyficzne dla pobranego antygenu. Utworzony przez nie kompleks związał dopełniacz i uniemożliwił jego udział w reakcji hemolizy. Jeżeli w probówkach nastąpi hemoliza, wynik reakcji ocenia się jako ujemny. W tym przypadku nie ma zgodności między antygenem a przeciwciałem, dopełniacz nie jest związany i uczestniczy w reakcji hemolizy.

Równolegle z surowicą pacjenta wykonuje się to samo doświadczenie ze znaną surowicą dodatnią (czyli z surowicą, w której znajdują się przeciwciała na dany antygen) i znaną ujemną, w której nie ma swoistych przeciwciał. Przy prawidłowym ustawieniu eksperymentu w pierwszym przypadku powinno nastąpić opóźnienie hemolizy, w drugim przypadku nastąpi hemoliza.

Intensywność reakcji wyraża się w następujący sposób:

Całkowite opóźnienie hemolizy. Erytrocyty tworzą jednolite zmętnienie lub osiadają na dnie. W takim przypadku ciecz w probówce staje się bezbarwna;

Zlizowano około 25% erytrocytów. Osad jest mniejszy, ciecz nad nim jest lekko różowa. Wynik RSC również ocenia się jako zdecydowanie pozytywny;

Zlizowano około 50% erytrocytów. Osad jest mały, ciecz jest różowa. Pozytywny wynik RSK;

Zlizowano około 75% erytrocytów. Niewielki osad, nad nim intensywnie zabarwiona ciecz. Wątpliwy wynik RSK;

Wszystkie erytrocyty poddano lizie. Płyn jest intensywnie zabarwiony i całkowicie przezroczysty. Wynik ujemny RSK.

Pytania kontrolne

1. Jaka jest zasada RSC?

2. Jakie systemy są zaangażowane w RSC? Z czego składa się układ hemolityczny i jaką rolę odgrywa w reakcji?

3. Jak wygląda przygotowanie do podstawowego doświadczenia RSC? W jakiej kolejności się to przeprowadza? Ile faz ma RSC?

4. Co oznacza brak hemolizy w CSC?

Ćwiczenia

1. Miareczkuj uzupełnienie i ustaw jego dawkę roboczą.

2. Oblicz wszystkie składniki potrzebne do przygotowania głównego eksperymentu, przeprowadź eksperyment, uwzględnij i narysuj wynik.

Reakcja immunofluorescencyjna

Test immunofluorescencyjny (RIF) wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną (patrz rozdział 2) do badań serologicznych. Reakcja polega na tym, że surowice odpornościowe, do których chemicznie przyłączone są fluorochromy, wchodząc w interakcję z odpowiednimi antygenami, tworzą specyficzny kompleks świetlny widoczny w mikroskopie fluorescencyjnym. Takie serum nazywane są luminescencyjnymi*. Metoda jest bardzo czuła, prosta, nie wymaga izolowania czystej kultury (można wykryć mikroorganizmy bezpośrednio w materiale pacjenta: kał w cholerze, plwocina w krztuścu, tkanka mózgowa w przypadku wścieklizny). Wynik można uzyskać już po pół godzinie od nałożenia na preparat serum luminescencyjnego. Dlatego RIF jest szeroko stosowany w ekspresowej (przyspieszonej) diagnostyce szeregu infekcji.

* (Fluorochromy: fluoresceina daje zieloną poświatę, rodamina - czerwoną.)

W celu przygotowania preparatów szkiełko z utrwaloną rozmazem (odciskiem, wycięciem) umieszcza się w wilgotnej komorze. Komorę przygotowuje się w następujący sposób. Mokrą bibułę filtracyjną umieszcza się na dnie szalki Petriego. Umieszcza się na nim równolegle dwa szklane pręty (można zastosować szeroką część pipet Pasteura). Umieszcza się na nich szkiełko z rozmazem do góry.

Uwaga! Nie zapomnij zakreślić rozmazu na odwrotnej stronie ołówkiem woskowym.

Na rozmaz nakłada się kroplę serum luminescencyjnego. Kubek zamyka się i umieszcza w termostacie lub pozostawia w temperaturze pokojowej na 20-30 minut. Po inkubacji przemywa się buforowanym roztworem izotonicznym (pH 7,4), płucze wodą destylowaną, suszy, nanosi kroplę buforowanej gliceryny, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym (nie grubszym niż 0,17 mm!) i ogląda pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jeśli preparat zawiera drobnoustroje homologiczne do luminescencyjnych przeciwciał surowicy, świecą one jasno na ciemnym tle. Ta metoda nazywa się bezpośrednią (ryc. 36). Wadą metody bezpośredniej RIF jest to, że dla każdego oznaczanego antygenu wymagane są surowice luminescencyjne, co jest trudne w przygotowaniu, a dla żadnego antygenu nie ma pełnego zestawu gotowych surowic luminescencyjnych. Dlatego często stosuje się metodę pośrednią. Polega to na tym, że w pierwszym etapie lek jest traktowany nieluminescencyjną surowicą immunospecyficzną wobec pożądanego antygenu. Jeżeli preparat zawiera pożądane antygeny (mikroby), wówczas tworzy się kompleks antygen-przeciwciało, którego nie widać. Po wysuszeniu, w drugim etapie, preparat poddaje się działaniu surowicy luminescencyjnej zawierającej przeciwciała nie przeciwko pożądanemu antygenowi, ale globulinom gatunku zwierzęcia, z którego otrzymano specyficzną surowicę. Na przykład, jeśli pierwszą surowicę uzyskano podczas immunizacji królika, druga powinna zawierać przeciwciała przeciwko globulinom króliczym (patrz ryc. 36). Przeciwciała te łączą się ze specyficznymi globulinami surowicy, które zostały zaadsorbowane na pożądanym antygenie, a kompleks świeci, gdy preparat jest oglądany pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Reakcja opsonofagocytarna

Reakcja opsonofagocytarna (OPR) jest jedną z metod oceny aktywności fagocytozy immunologicznej. Im wyższa jest ta aktywność, tym większa jest odporność organizmu na infekcje. W organizmie odpornościowym pod wpływem przeciwciał (opsonin) fagocytoza przebiega aktywniej (więcej drobnoustrojów zostaje wchłoniętych w krótszym czasie). Dlatego wskaźniki aktywności fagocytarnej mają nie tylko wartość diagnostyczną (na przykład w brucelozie), ale także pozwalają przewidzieć wynik procesu zakaźnego, oceniając wyniki leczenia i szczepień. Do reakcji potrzebujesz:

1. Antygen – zawiesina żywych lub zabitych mikroorganizmów.

2. Przeciwciało (opsoniny) – surowica testowa.

3. Fagocyty - zwykle neutrofile badanej krwi.

Ustawienie reakcji. Za pomocą mikropipety do małych probówek wlewa się 0,05 ml 2% roztworu cytrynianu sodu; 0,1 ml badanej krwi i 0,05 ml zawiesiny mikroorganizmów, których gęstość odpowiada 10 jednostkom w 1 ml. zmętnienie zgodnie ze standardem optycznym GISK.

Uwaga! Do każdego składnika należy użyć osobnej pipety.

Wymieszać zawartość probówek. Probówki umieszcza się w termostacie na 30 minut, po czym ponownie miesza się ich zawartość i przygotowuje się cienkie rozmazy (jak rozmazy krwi). Barwiony według Romanowskiego – Giemsy.

Rozliczanie wyników. W różnych miejscach rozmazu zlicza się 25 neutrofili, biorąc pod uwagę liczbę wychwyconych mikroorganizmów w każdym z nich. Wskaźnik reakcji opsonofagocytarnej (POFR) oblicza się ze wzoru:

POFR = 3a + 2b + 1c + 0,

gdzie a jest liczbą neutrofili zawierających więcej niż 41 bakterii; b - liczba neutrofili zawierających od 21 do 40 bakterii; c jest liczbą neutrofili zawierających od 1 do 20 bakterii; 0 - liczba neutrofili niezawierających bakterii.

Maksymalny wskaźnik reakcji opsonofagocytarnej w tym systemie rozliczeniowym wynosi 75.

Wynik reakcji ocenia się według następującego schematu:

z POFR od 1 do 24 - słabo dodatnie;

z POFR od 25 do 49 - wymawiane;

z POFR od 50 do 75 - ostro dodatnie.

U zdrowych osób POFR wynosi 0-1, rzadko 4-5. Wyraźne i wyraźnie pozytywne wyniki reakcji wskazują na silne działanie opsonizujące surowicy osoby badanej z wyraźną aktywnością fagocytów krwi.

Określenie jedynie aktywności przeciwciał – opsonin przeprowadza się poprzez doświadczenie ustalenia indeksu opsoicznego – stosunku indeksu fagocytarnego w obecności surowicy odpornościowej (testowanej) do indeksu fagocytarnego w surowicy, która oczywiście nie zawiera przeciwciał przeciwko danego drobnoustroju. Doświadczenie przeprowadza się w następujący sposób: pobiera się 2 probówki, do jednej (doświadczalnej) dodaje się w równych ilościach (zwykle 0,2 ml): 1) surowicę osoby badanej; 2) zawiesina drobnoustrojów, w której oznacza się obecność opsonin; 3) leukocyty (możliwe z jamy brzusznej myszy). Do probówki kontrolnej dodaje się: 1) surowicę bez opsonin (kontrola); 2) te same drobnoustroje, co w doświadczeniu doświadczalnym; 3) leukocyty (takie same jak w probówce).

Obie probówki trzyma się w termostacie przez 30 minut, po czym z jednej i drugiej przygotowuje się rozmazy, utrwala i barwi według Romanovsky-Giemsa. Rozmazy poddaje się mikroskopii i oznacza w probówkach doświadczalnych i kontrolnych indeks fagocytarny.

W obecności opsonin w surowicy testowej indeks opsoniczny będzie większy niż jeden. Im większa liczba uzyskana z podzielenia wskaźnika fagocytozy surowicy testowej przez wskaźnik fagocytarny surowicy kontrolnej, tym wyraźniejsze jest działanie przeciwciał - opsonin.

Pytania kontrolne

1. Na jakiej właściwości przeciwciał opiera się OPA? Czy ta reakcja jest specyficzna?

2. Co oznacza wynik OFR wynoszący 75?

Ćwiczenia

Zbadaj OFR krwi pobranej z palca. Narysuj fagocyty. Oblicz PORF.

Reakcje odpornościowe in vivo (testy skórne)

Stosując antygen na skrawkowatą skórę lub śródskórnie, można wykryć zarówno stan odporności, jak i stan nadwrażliwości na ten lek.

Test skórny z toksyną. Odmierzoną ilość toksyny wstrzykuje się śródskórnie. Jeśli organizm jest odporny, to znaczy ma określony poziom antytoksyny, działanie toksyny nie ujawni się - toksyna zostanie przez nią zneutralizowana. U organizmu nieodpornego w miejscu wstrzyknięcia toksyny rozwinie się naciek zapalny (zaczerwienienie, stwardnienie itp.).

Testy skórne na alergeny(testy alergiczne skórne) w celu zbadania reakcji o nasilonym charakterze (patrz rozdział 13). Przy zwiększonej wrażliwości typu bezpośredniego wprowadzony alergen (antygen) reaguje z przeciwciałami zaadsorbowanymi na komórkach różnych narządów. Nadwrażliwość typu opóźnionego wynika z reakcji na alergen uczulonych limfocytów T. Takie uczulenie występuje w przypadku szeregu infekcji u pacjentów, którzy byli chorzy i zaszczepieni (gruźlica, bruceloza itp.). Dlatego testy alergiczne skórne na te infekcje mają wartość diagnostyczną.

Preparaty do testów skórnych przygotowywane są przez specjalnych producentów, podając instrukcje ich stosowania.

Pytania kontrolne

1. Co to jest przeciwciało w skórnym teście na toksyny? O czym świadczy negatywny wynik tego testu?

2. Jaka reakcja pozwala rozpoznać stan zwiększonej wrażliwości organizmu na czynnik zakaźny?

Immunoprofilaktyka i immunoterapia chorób zakaźnych

Próby zapobiegania ciężkiemu przebiegowi śmiertelnej choroby poprzez wywołanie jej łagodnej postaci podejmowane są od wieków w różnych krajach świata.

Naukowe uzasadnienie i praktyczne wdrożenie immunoprofilaktyki jako pierwszy podał L. Pasteur, który stworzył zasady stosowania osłabionych (atenuowanych) drobnoustrojów i przygotowanych preparatów (szczepionek) do zapobiegania niektórym chorobom zakaźnym u ludzi i zwierząt.

Minęło ponad sto lat i obecnie sztuczne tworzenie odporności jest podstawą walki z chorobami zakaźnymi.

Szczepienia - wprowadzenie leków w celu wytworzenia sztucznej czynnej odporności - przeprowadza się w określonych latach przez całe życie człowieka. Już w pierwszych dniach po urodzeniu dziecko otrzymuje szczepionkę BCG przeciwko gruźlicy. W pierwszym roku życia jest szczepiony przeciw błonicy, krztuścowi i tężcowi, szczepiony przeciwko poliomyelitis, odrze itp. W ten sposób prowadzona jest specyficzna profilaktyka chorób zakaźnych, na które stosuje się szczepionki.

Szczepionki- preparatami do czynnego uodporniania mogą być:

1. Korpuskularny (z komórek drobnoustrojów) - żywy i martwy.

2. Chemiczne (antygeny i frakcje antygenowe).

3. Anatoksyny.

Żywe, atenuowane szczepionki przygotowywane są z żywych mikroorganizmów, których zjadliwość jest osłabiona (od łacińskiego attenuer - osłabiać, zmiękczać), a właściwości immunogenne (zdolność wywoływania odporności) są zachowane.

Istnieją różne sposoby uzyskania takich mikroorganizmów:

1) uprawa na pożywkach niekorzystnych dla wzrostu i rozmnażania patogenu; pod wpływem czynników fizycznych i chemicznych (w ten sposób uzyskano szczepionkę BCG do zapobiegania gruźlicy); 2) przejście patogenu przez organizm zwierzęcia mało podatnego na powtarzalne zakażenie (w ten sposób L. Pasteur otrzymał szczepionkę przeciwko wściekliźnie); 3) selekcja naturalnych kultur mikroorganizmów lekko zjadliwych dla człowieka (w ten sposób uzyskano szczepionkę na dżumę) itp.

Żywe szczepionki tworzą intensywną odporność, ponieważ powodują proces podobny do naturalnej choroby zakaźnej, tylko łagodnie zaznaczony, prawie bez objawów klinicznych. W tym przypadku aktywowany jest cały mechanizm immunogenezy - powstaje odporność.

Zabite szczepionki to kultury mikroorganizmów inaktywowane działaniem wysokiej temperatury, środków chemicznych (fenolu, formaliny, alkoholu, acetonu), promieni UV itp. Jednocześnie dobiera się takie czynniki oddziaływania, które w pełni zachowują właściwości immunogenne komórek drobnoustrojów.

Szczepionki chemiczne to pojedyncze składniki komórki drobnoustroju (antygeny) otrzymywane w wyniku specjalnej obróbki zawiesiny drobnoustrojów.

Szczepionki chemiczne po wprowadzeniu do organizmu zwykle szybko się wchłaniają, co nie pozwala na osiągnięcie pożądanej stymulacji immunogennej, dlatego do szczepionek dodaje się substancje wydłużające czas wchłaniania: wodorotlenek glinu, ałun glinowo-potasowy, oleje mineralne itp. Nazywa się to utworzeniem „magazynu”.

Szczepionki chemiczne stosuje się w celu zapobiegania durowi brzusznemu, zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych itp.

Anatoksyny (od łac. ana - tył) to egzotoksyny bakterii, neutralizowane przez ekspozycję na formalinę (0,3-0,4%) i ekspozycję na temperaturę 37°C przez 3-4 tygodnie. W tym przypadku następuje utrata właściwości toksycznych, ale zachowanie właściwości immunogennych.

Obecnie toksoidy pozyskiwano i stosowano z toksyn patogenów błonicy, tężca itp.

Anatoksyny są oczyszczane z zanieczyszczeń pożywki (białka balastowe) i absorbowane na substancjach wolno wchłanianych z miejsca wstrzyknięcia.

W zależności od liczby antygenów tworzących szczepionkę rozróżnia się: monoszczepionki (z jednego rodzaju antygenów), diszczepionki (z dwóch antygenów), trzy szczepionki (z trzech antygenów) itp.

Powiązane szczepionki są przygotowywane z antygenów różnych bakterii i toksoidów. Na przykład powiązana szczepionka przeciwko krztuścowi, błonicy i tężcowi (DPT) zawiera zabite drobnoustroje krztuścowe i toksoidy: błonicę i tężec.

Szczepionki podaje się domięśniowo, podskórnie, skórnie, śródskórnie, doustnie. Immunizować raz, dwa i trzy razy w odstępach 1-2 tygodni lub dłuższych. Częstotliwość podawania, odstępy między szczepieniami zależą od charakteru szczepionki – dla każdego opracowano schematy podawania.

Po wprowadzeniu szczepionki mogą wystąpić reakcje ogólne i miejscowe. Często obejmują gorączkę (do 39°C), ból głowy, złe samopoczucie. Zjawiska te zwykle ustępują w ciągu 2-3 dni. Reakcje miejscowe - zaczerwienienie i naciek w miejscu wstrzyknięcia mogą pojawić się 1-2 dni po szczepieniu. Po podaniu szczepionki na skórę (przeciwko tularemii, BCG itp.) pojawienie się miejscowej reakcji wskazuje na skuteczność szczepionki.

Istnieją przeciwwskazania do szczepienia: gorączka, ostre choroby zakaźne, alergie itp. Nie szczepić kobiet w drugiej połowie ciąży.

Szczepionki i toksoidy przygotowywane są w przedsiębiorstwach produkujących preparaty bakteryjne. Do ich produkcji potrzebne są duże ilości zawiesiny drobnoustrojów (biomasy) lub materiału zawierającego wirusy.

Gotowe preparaty rozlewa się do ampułek lub fiolek i najczęściej suszy. Preparaty suche dłużej zachowują aktywność i inne właściwości.

Niektóre szczepionki, takie jak polio, są dostępne w postaci tabletek lub drażetek.

Do każdej ampułki, butelki i pudełka z lekami dołączone są etykiety zawierające nazwę leku, jego objętość, datę ważności, numer serii i numer kontrolny.

Instrukcje użytkowania znajdują się w każdym pudełku.

Preparaty przechowywać głównie w temperaturze 4°C. Nie narażać preparatów na działanie zamrażania i rozmrażania, wysokie temperatury. Podczas transportu przestrzegane są specjalne warunki. Nie należy stosować leków, które mają pęknięcia w ampułkach i zmieniony wygląd.

W ZSRR istnieje system państwowej kontroli jakości medycznych preparatów immunobiologicznych, który zapewnia ich skuteczność i standaryzację.

Specjalny rodzaj szczepionki – a potem szczepionka. Przygotowuje się je w laboratoriach bakteriologicznych z drobnoustrojów wyizolowanych od pacjenta. Autoszczepionkę stosuje się tylko u tego pacjenta. Najczęściej autoszczepionki stosuje się w leczeniu przewlekłych infekcji (gronkowce itp.). Autoszczepionkę podaje się wielokrotnie, w małych dawkach, według schematu opracowanego dla każdej szczepionki. Autoszczepionki stymulują mechanizmy obronne organizmu, co przyczynia się do powrotu do zdrowia.

Preparaty serum wykorzystywane do tworzenia sztucznej odporności biernej. Należą do nich specyficzne surowice odpornościowe i immunoglobuliny.

Preparaty te zawierają gotowe przeciwciała. Pozyskuje się je z krwi dawców – specjalnie uodpornionych ludzi lub zwierząt (przeciwko odrze, grypie, tężcowi). Ponadto stosuje się surowicę osób ozdrowieńców, a nawet zdrowych, jeśli zawiera wystarczającą ilość przeciwciał. Krew łożyskowa i poronna wykorzystywana jest także jako surowiec do sporządzania preparatów immunologicznych.

Istnieją serum antybakteryjne i antytoksyczne. Te pierwsze mają bardziej ograniczone zastosowanie. Surowice antytoksyczne stosuje się w leczeniu błonicy, tężca, zatrucia jadem kiełbasianym itp. Surowice te produkowane są z określoną zawartością antytoksyny, mierzoną w jednostkach międzynarodowych (IU).

Preparaty surowicy odpornościowej pozyskiwane są z krwi zwierząt, głównie koni, wielokrotnie szczepionych. Na zakończenie immunizacji określa się poziom przeciwciał we krwi i przeprowadza się upuszczanie krwi. Powstała surowica jest zachowywana, kontrolowana jest jej sterylność, aktywność i właściwości fizyczne.

Preparaty pochodzące z krwi koni zawierają białka obce człowiekowi, które powtarzane mogą powodować reakcje alergiczne: chorobę posurowiczą i wstrząs anafilaktyczny. Aby zapobiec powikłaniom, preparaty surowicy należy podawać ostrożnie (wg Bezredki) (patrz rozdz. 13). Do uwalniania surowic zwierzęcych od białek balastowych i zagęszczania przeciwciał stosuje się różne metody, z których główną jest opracowana w naszym kraju metoda Diaferm-3, obejmująca enzymatyczną hydrolizę białek balastowych.

Dodatkowo, w celu zatężenia przeciwciał w mniejszej objętości leku, opracowano metody izolacji gamma globulin zawierających przeciwciała z surowicy krwi. Leki te nazywane są immunoglobulinami. Przygotowuje się je z surowicy ludzkiej (homologicznej) i zwierzęcej (heterologicznej).

Skuteczność immunoglobulin jest znacznie wyższa niż surowic odpornościowych, a powikłań jest nieproporcjonalnie mniej. Obecnie immunoglobuliny są stosowane znacznie szerzej niż surowice.

W naszym kraju immunoglobuliny stosuje się w profilaktyce odry, zapalenia wątroby, różyczki itp. Profilaktyczne podawanie immunoglobulin przeprowadza się w przypadku podejrzenia zakażenia lub wystąpienia zakażenia. Wskazane jest podawanie tych leków w pierwszych dniach po zakażeniu (początek okresu inkubacji), gdy proces patologiczny nie jest jeszcze rozwinięty.

W terapeutycznym zastosowaniu leku, jego wczesne podanie daje większy efekt.

Surowicę i immunoglobuliny podaje się domięśniowo i dożylnie.

Terminowe i prawidłowe stosowanie preparatów surowicy może zmniejszyć częstość występowania wielu infekcji.

Pytania kontrolne

1. Jakie znasz rodzaje szczepionek?

2. Jakie leki tworzą odporność bierną?

3. Co to jest autoszczepionka?

Zdolność organizmu do przeciwstawienia się wpływom zewnętrznym, a jednocześnie utrzymania stałości środowiska wewnętrznego, wiąże się zarówno z funkcjonowaniem nieswoistych mechanizmów obronnych, jak i zdolnością do wytworzenia wysoce wyspecjalizowanej formy reakcji – odpowiedzi immunologicznej. Układ odpornościowy odgrywa ważną rolę w złożonym mechanizmie adaptacji organizmu człowieka, zapewniając zachowanie homeostazy antygenowej, której naruszenie może wynikać z przenikania obcych antygenów do organizmu lub samoistnej mutacji. Mechanizmy mające na celu eliminację obcego agenta są niezwykle różnorodne. W tym przypadku można wyróżnić dwa pojęcia: „niespecyficzne czynniki ochronne” i „reaktywność immunologiczna”.

Oporność nieswoista rozumiana jest jako zdolność organizmu do przeciwstawiania się działaniu obcych czynników poprzez stereotypowe mechanizmy powstałe w procesie ewolucji. To one jako pierwsze chronią organizm, dając mu czas na wytworzenie pełnoprawnej odpowiedzi immunologicznej. Ochrona organizmu przed infekcjami zależy od stopnia przepuszczalności drobnoustrojów chorobotwórczych skóry i błon śluzowych, obecności w ich wydzielinach substancji bakteriobójczych oraz kwasowości treści żołądkowej. Mechanizmy oporności nieswoistej dzielą się na komórkowe i humoralne. Reakcje komórkowe są reprezentowane przez fagocytozę, która jest przeprowadzana głównie przez neutrofile i makrofagi.

Czynniki humoralne obejmują układ dopełniacza, lizozym, białka ostrej fazy zapalenia, interferony itp. Wszystkie te mechanizmy są nieswoistymi czynnikami ochronnymi, ponieważ istnieją niezależnie od obecności lub nieobecności patogenu. Jednak pomimo nieswoistości fagocytozy, makrofagi biorą udział w przetwarzaniu antygenu (AG), we współpracy limfocytów T i B podczas odpowiedzi immunologicznej, czyli w specyficznych formach odpowiedzi na obce substancje.

Podobnie wytwarzanie dopełniacza nie jest specyficzną odpowiedzią na antygen, ale klasyczny szlak aktywacji układu dopełniacza jest inicjowany przez kompleks antygen-przeciwciało.

Reaktywność immunologiczna- jest to zdolność organizmu do reagowania na działanie antygenu specyficznymi dla niego reakcjami komórkowymi i humoralnymi. Zdolność ta wynika z istnienia dwóch typów komórek odpornościowych: limfocytów T, które bezpośrednio reagują z antygenem i przeprowadzają komórkowe reakcje odpornościowe, oraz limfocytów B, które pod wpływem antygenu przekształcają się w komórki plazmatyczne, które wytwarzają immunoglobuliny odpowiedzialne za humoralne reakcje immunologiczne. Limfocyty T i B niosą na swojej powierzchni specyficzne receptory umożliwiające rozpoznawanie antygenu.

Kiedy substancje antygenowe dostaną się do organizmu:

prezentacja i rozpoznawanie antygenu;

reprodukcja limfocytów T i B klonu niosącego receptory lub wytwarzającego przeciwciała przeciwko temu antygenowi, kończąca się tworzeniem subpopulacji limfocytów i przeciwciał;

specyficzne oddziaływanie subpopulacji limfocytów T i przeciwciał z antygenem;

tworzenie kompleksów antygen-przeciwciało z udziałem leukocytów krwi, substancji biologicznie czynnych, które przyspieszają inaktywację antygenu w organizmie;

tworzenie pamięci immunologicznej;

zapobieganie i hamowanie wytwarzania przeciwciał przeciwko składnikom własnego organizmu, czyli indukowanie i utrzymywanie tolerancji immunologicznej na własne antygeny.

Komórkowa odpowiedź immunologiczna. Limfocyty T różnią się obecnością antygenów markerowych (obecnie istnieje już ponad 10 typów komórek T). Według zdolności do interakcji z antygenem i innymi limfocytami wyróżnia się główne subpopulacje limfocytów T:

Pomocnicy T, którzy pomagają innym limfocytom T i B reagować na antygen (istnieje kilka typów: Th1, Th2, Th3, Th17);

regulatory T (supresory), które hamują reakcję innych limfocytów;

Leki T-zabójcze, które indukują apoptozę w komórkach docelowych poprzez uwalnianie cytotoksycznych limfokin, ekspresję receptorów śmierci na powierzchni lub wytwarzanie perforyn (granzymów).

Humoralna odpowiedź immunologiczna. W okresie zależnym od antygenu limfocyty B krwi i narządów obwodowych układu odpornościowego są pobudzane przez antygen i osadzają się w strefach B śledziony i węzłów chłonnych (w pęcherzykach i ośrodkach rozrodczych), gdzie ulegają wybuchowi. transformacja: z małych limfocytów zamieniają się w duże komórki proliferujące, a następnie w komórki plazmatyczne. W komórkach plazmatycznych zachodzi synteza immunoglobulin, które dostają się do krwioobiegu. Osoba wytwarza pięć klas przeciwciał (immunoglobulin): IgD, IgM, IgG, IgA, IgE.

Swoistość interakcji z antygenem osiąga się poprzez dopasowanie miejsca aktywnego przeciwciała do determinanty antygenu. Dzięki połączeniu mechanizmów zapewniających mutację i zróżnicowanie regionów zmiennych, ich rekombinację, organizm reaguje na ogromną liczbę bodźców

różnorodne antygeny.

Wysoki stopień odpowiedzi na antygen wynika z jednoczesnego rozwoju komórkowych i humoralnych odpowiedzi immunologicznych różnego typu, a także poliklonalnego charakteru odpowiedzi immunologicznej na konkretny antygen. Efekt ten tłumaczy się współpracą makrofagów, limfocytów T i B,

reprodukcja klonów komórkowych po stymulacji antygenem. Wypracowanie skutecznej odpowiedzi immunologicznej jest możliwe jedynie przy współpracy z komórkami mikrośrodowiska: śródbłonkiem naczyń, komórkami zrębowymi (dendrytami, komórkami tucznymi, fibroblastami, makrofagami itp.), które tworzą tło cytokinowe i biorą udział w tworzeniu ogniska zapalnego. Interferony α, β, γ, czynnik martwicy nowotworu (TNF), chemokiny, interleukiny, a także czynniki stymulujące tworzenie kolonii i czynniki wzrostu naskórka, granulocytów, makrofagów, naczyń i nerwów powstają jako mediatory współpracy podczas immunogenezy.

Skuteczność niszczenia antygenów związanych z komórkami w procesie reakcji immunologicznych wynika z czynników, które mogą zabić odpowiednie komórki. Reakcje zabójcze obejmują: indukcję apoptozy komórek docelowych przez leki T-kill, wytwarzanie cytotoksycznych cytokin, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał, cytotoksyczność zależną od dopełniacza.

W stosunku do potencjalnych antygenów organizmu rozwija się tolerancja immunologiczna (tolerancja specyficzna, brak reakcji). Rozwija się przez całe życie. Jednocześnie w wyniku mutacji genowych w organizmie powstają nowe klony limfocytów T i B, w tym te, które potrafią reagować ze swoimi antygenami. W grasicy takie klony limfocytów T są eliminowane. Zakazane klony limfocytów B, nietolerujące antygenów swojego organizmu, są albo hamowane przez rodzaj tolerancji na wysokie dawki, albo pozostają niehamowane. Okazało się, że u zdrowych ludzi część limfocytów B nie toleruje antygenów swojego organizmu. Jednakże nie zachodzi proces autoimmunologiczny, ponieważ bez komórek pomocniczych T limfocyty B nie są stymulowane przez antygen.