Qu’est-ce que SCL ? Skl - culture mixte de lymphocytes.

2.2. Méthodes d'interactions cellulaires

Presque toutes les méthodes sont basées interactions cellulaires, utilisé en immunogénétique clinique, réside le phénomène de formation de blastes dans une culture mixte de lymphocytes, découvert par la chercheuse canadienne Barbara Bain. La réaction d'une culture lymphocytaire mixte (MLC) a permis de réaliser une étude finement différenciée du complexe HLA et notamment d'une de ses sous-unités - le locus HLA-D. Un certain nombre d'autres méthodes d'interactions cellulaires - lympholyse à médiation cellulaire (CML), test d'amorçage des lymphocytes (Primed Lymphocyte Typing) - sont basées sur la méthode MLC ou la contiennent comme partie intégrante.

2.2.1. Culture mixte de lymphocytes (MCL)

Le principe de la méthode est présenté sur la Fig. 10, d'où il ressort clairement que deux populations de lymphocytes génétiquement différents interagissent l'une avec l'autre en culture in vitro. Une des populations est traitée à la mitomycine C ou irradiée, ce qui lui fait perdre la capacité de former des blastes et d'incorporer de la thymidine (3 HT), cependant, sans perdre ses propriétés antigéniques, elle conserve la capacité de stimuler (stimulants ; S -population).

Les cellules qui répondent à la stimulation (répondeurs, population R) se transforment en blastes après quelques jours et incluent de la thymidine ajoutée à la culture. L'intensité de la réaction est mesurée à l'aide d'un radiotraceur pour l'incorporation de 3H-thymidine.

Plusieurs variantes de la réaction d'une culture mixte de lymphocytes sont connues, dont deux sont proposées ici : la traditionnelle et la microvariante mise en œuvre dans les comprimés Cook (Fig. 11).

Riz. 11. Équipement pour les micro-variantes MLC et CML. 1 - tablette à fond rond avec 96 trous ; 2-pipettes automatiques (« Pipetman ») avec un programme pour différents volumes ; 3 - pipette automatique ("Sigma") pour un certain volume ; 4 - pointe de pipette jetable ; 5 - boîte à flux laminaire

Version traditionnelle de MLC (modification par F. S. Baranova) :

Les lymphocytes sont isolés sur un gradient Ficoll-urografine comme décrit ci-dessus. Le premier lavage est effectué dans du PBS (NaCl - 8,0 g, Na 2 HP0 4 - 1,15 g, KH 2 PO 4 - 0,2 g, KC1 - 0,2 g pour 1 litre de H 2 O) ; les deux suivants sont réalisés en milieu 199 avec 5% de sérum AB (pool de 15 donneurs) ;

Les cellules répondantes sont remises en suspension dans du milieu 199 avec 10 % de sérum AB et la concentration cellulaire est ajustée à 0,6 x 10 6 par ml ;

Les cellules stimulantes isolées de la même manière à une concentration de 5 - 10 6 pour 1 ml sont traitées avec de la mitomycine C (60 y/ml) de Serva et incubées pendant 40 minutes à 37°C dans un bain-marie. Après incubation, les cellules sont lavées 3 fois avec du milieu 199 à 5 % de sérum AB, remises en suspension dans du milieu 199 à 10 % de sérum AB en portant la concentration à 0,6 x 10 6 dans 1 ml ;

0,5 ml de cellules répondeuses et 0,5 ml de cellules stimulantes sont mélangés dans un tube à centrifuger, 0,04 ml de 10 ml de solution Hepes (Serva) sont ajoutés et incubés pendant 144 heures ; l'expérience est placée en trois parallèles (triplet) ;

24 heures avant la fin de l'incubation, on ajoute dans les tubes à essai 3H-thymidine 1μCi (3,7x10 4 BC), l'échantillon d'activité spécifique est de 5mCi/mmol (18,5x10 7 BC/mmol) et l'incubation est poursuivie ;

A la fin de l'incubation, les cellules sont transférées sur des filtres millipores (0,6 - 0,9 microns) et lavées solution saline(37 °C) et une solution refroidie à 5 % d'acide trichloroacétique (4 °C). Les filtres sont séchés et placés dans des flacons avec 5 ml de liquide de scintillation (5 g de PPO et 0,5 g de POPOP - pour 1 litre de toluène)*. L'activité d'incorporation de 3H-thymidine est mesurée dans un compteur β ; le résultat est exprimé en inclusions absolues du marqueur radioactif par 1 min ou en indice de stimulation (SI) selon la formule :

* (PPO - 2,5-phénol-oxazole ; POPOR - (1,4-di-2-15-phénoloxazolitebenzène).)

Valeur CPM moyenne dans trois prototypes

SI = valeur moyenne du CPM dans trois échantillons de contrôle/des cultures spontanées de cellules répondantes servent d'échantillons de contrôle.

Version micro de MLC dans les tablettes Cook. Lors du 8e atelier, des exigences ont été élaborées pour standardiser la micro-option MLC, conformément auxquelles elle est exposée ci-dessous :

Les lymphocytes sont isolés dans un gradient isopaque-ficoll et remis en suspension dans du milieu RPMJ-1640* en portant la concentration à 5x10 5 dans 1 ml ;

* (Le milieu 199 mélangé à du sérum humain du groupe AB (5% de sérum prélevé sur plusieurs individus) peut être utilisé.)

Les cellules stimulatrices sont traitées avec de la mitomycine C ou de l'entraînement ;

5x10 4 répondeurs et le même nombre de stimulateurs sont placés à l'aide d'une micropipette de type Pipetman dans chaque puits d'une microplaque à fond rond Cook ;

Les plaques sont incubées dans un thermostat avec apport automatique de 5% CO 2 pendant 120 heures ; puis lμmCi 3 H-thymidine est ajouté dans chaque puits à une activité spécifique de thymidine 6 Ci/mmol ; toutes les manipulations sont réalisées avec une pipette Pipetman ;

16 heures après l'ajout de thymidine, les cultures de chaque puits sont transférées sur des filtres millipores à l'aide d'une pipette automatique et lavées au sérum physiologique puis à l'acide trichloroacétique à 5 % ; il est pratique d'utiliser des « récolteuses » spéciales pour transférer la culture vers des filtres millipores ;

L'activité d'incorporation de thymidine a été déterminée comme décrit ci-dessus.

2.2.2. Lympholyse à médiation cellulaire (LMC)

La LMC a été utilisée relativement récemment dans des études immunogénétiques (depuis 1972), mais dans Dernièrement devient une technique de plus en plus populaire, permettant une étude détaillée du rôle du lien efférent de l'immunité à la transplantation et étant reconnue comme méthode informative surveillance immunologique. Le principe de la méthode est présenté sur la Fig. 12. La méthode est basée sur la technique proposée par J. Lightbody (1971), qui est brièvement résumée comme suit.

1. La LMC commence par un test HLC conventionnel, dans lequel les cellules répondeuses reconnaissent des « stimulateurs », sensibilisent les cellules répondeuses et forment des cellules tueuses sensibilisées.

2. La deuxième phase, au cours de laquelle les cellules tueuses sensibilisées se mélangent aux cellules cibles marquées au 51 Cr, consiste en la destruction de ces dernières par les cellules tueuses effectrices ; les cellules cibles peuvent avoir le même génotype que les « stimulateurs » de la première phase de MLC, ou bien il peut s'agir de cellules d'un « tiers » partenaire, dotées de déterminants antigéniques communs aux « stimulateurs » ou sans eux.

3. La quantité de chrome radioactif libérée par les cellules cibles détruites et libérée dans le milieu de culture sert de mesure de l'intensité de l'effet tueur.

Riz. 12. Principe de la lympholyse à médiation cellulaire (LMC). Rangée I - sensibilisation des cellules répondeuses, formation de cellules tueuses ; Rangée II - interaction des tueurs avec la cible ; Rangée III - destruction de la cellule cible ; rendement 51 Cr milieu de culture

Trois variantes de CML sont décrites ici : version traditionnelle modifié par L.P. Alekseev (1979), micro-version en comprimés Cook, direct CML (Direct-CML -D-CML.

Option traditionnelle[Alekseev L.P., 1979].

La méthode est divisée en plusieurs étapes.

Obtenir des tueurs à gages:

Les lymphocytes périphériques des deux populations (cellules R et cellules S) sont isolés de la manière habituelle, lavés trois fois en gradient de densité dans du milieu 199 avec du sérum AB 5% (10 min, 150 g) ;

1 x 10 6 cellules R (0,8 ml) sont mélangées dans des tubes à centrifuger avec 2 x 10 6 cellules S (0,2 ml) traitées avec de la mitomycine C et incubées pendant 144 heures à 37°C ;

Les cellules sont centrifugées à 150 g pendant 10 minutes, et le sédiment est remis en suspension dans du milieu 199 additionné de 20 % de sérum de veau (milieu 199 + soit), portant la concentration à 1x10 6 dans 1 ml ;

L'un des échantillons est laissé pour étudier le niveau MLC, les autres sont utilisés comme tueurs prêts à l'emploi.

Obtenir des cibles:

Les lymphocytes isolés de la manière habituelle sont remis en suspension dans du milieu 199 avec 20 % de sérum AB et incubés avec de la phytohémagglutinine (0,003 mg/ml Wellcome) pendant 72 heures à 37°C ; concentration cellulaire 1x10 6 dans 1 ml ;

Les cellules sont centrifugées 10 min à 150 g, le sédiment est remis en suspension dans du milieu 199 avec 5% de sérum AB et la concentration cellulaire est ajustée à 2x10 4 dans 1 ml ;

51 Cr, 100 µCi/ml (3,7 x 10 6 BC/ml) sont ajoutés à la suspension et incubés pendant 40 minutes à 37°C ;

Les cellules sont lavées trois fois dans du milieu 199 additionné de sérum AB 5% (150 g, 10 min) et le sédiment est remis en suspension dans du milieu 199 avec sérum AB 5%. porter la concentration à 2x10 4 dans 1 ml.

Mise en place de réactions:

5 x 10 5 tueurs (0,5 ml) sont mélangés avec 1 x 10 4 cibles (0,5 ml), incubés pendant 4 heures (37°C) et centrifugés à 150 g pendant 10 minutes ;

Le surnageant est aspiré et l'impulsion provoquée par le 51 Cr est comptée sur un compteur ; le comptage est effectué dans 0,5 ml de surnageant ;

Le niveau de cytolyse est calculé à l'aide de la formule suivante :

Ekper. sortie 51 Cr - sortie spontanée 51 Cr/max, sortie 51 Cr - sortie spontanée 41 Cr × 100.

La libération spontanée de chrome est mesurée sur des cibles incubées 4 heures (37°C) sans cellules tueuses ; rendement maximal en chrome - sur des cibles complètement détruites par le gel et le dégel ; Tous les tests sont effectués en triplets.

Micro-variante de CML en comprimés [d'après Mawas S., 1976] :

La phase d'obtention des tueurs est réalisée en MLC dans des plaques à fond rond, mais les cellules R et S sont mélangées en quantités égales, 2x10 5 pa chaque puits et incubées à 37°C ;

Après 5 jours, les cellules sont récupérées à la pipette Pasteur dans un tube à essai, le nombre de cellules vivantes est compté au bleu trypan et la concentration est ajustée à 10x10 6 dans 1 ml ;

Les cellules cibles sont cultivées avec du PHA pendant 3 jours ;

Le jour de la réaction, les cellules cibles sont lavées (300 g) et remises en suspension dans un milieu de culture en répartissant 1 ml dans des tubes à essai et en ajustant à 1x10 6 dans 1 ml ;

Ajouter 200 μCi 51 Cr (7,4 x 10 6 BC) à chaque tube contenant des cellules cibles et incuber pendant 1 heure à 37 °C ; laver les cellules 3 fois ; le sédiment est remis en suspension et ajusté à une concentration de 1x10 dans 1 ml (vivant) ;

Le test est réalisé dans des microplaques à fond rond ; pour cela, 0,7 - 1x10 6 cellules tueuses (0,1 ml) et 1x10 4 cellules cibles (0,1 ml) sont réparties dans chaque puits ; le volume total de la suspension dans chaque puits est de 0,2 ml, ajouter 0,05 ml de milieu dans chaque puits et incuber (37°C) pendant 4 heures ;

Les plaques sont centrifugées à 800 g sur centrifugeuse Beckman pendant 10 minutes ; le surnageant de chaque puits est transféré dans des tubes à essai et compté sur un compteur γ ;

La phase de production de cellules tueuses (MLC) est réalisée sur milieu RPMJ-1640 additionné de 20% de plasma humain ; pour la phase de destruction, utiliser du milieu MEM additionné de 20% de plasma humain, préchauffé.

CML directe (D-CML). Direct CML est une technique développée spécifiquement à des fins cliniques qui a été utilisée dans la surveillance immunologique. Le schéma de cette réaction est présenté sur la Fig. 13.

La principale différence avec la LMC traditionnelle est que l’étape de formation des cellules tueuses (phase de sensibilisation) ne se produit pas in vitro, mais in vivo, c’est-à-dire dans le corps humain sensibilisé par la transplantation d’un organe ou d’un tissu allogénique. Grâce à l'action du tissu allogénique, les lymphocytes du receveur sont sensibilisés aux antigènes tissulaires du donneur et ne nécessitent pas de traitement particulier in vitro ; la durée du test est considérablement réduite, car seules les cibles doivent d'abord être préparées.

Lymphocytes obtenus à partir de sang périphérique ou, plus communément, à partir de la rate du donneur (voir 2.1.2) et congelé par l'une des méthodes décrites ci-dessus (voir 2.1.3).

2.2.3. Cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC)

Ce type réactions cellulaires mécanisme d'action similaire à celui de la CML décrite ci-dessus. Le principe de la réaction est illustré sur la Fig. 14. Les composants de la réaction sont les cellules cibles (cellules donneuses ou lymphocytes allogéniques), le sérum (allogénique ou receveur), contenant vraisemblablement des anticorps dirigés contre les déterminants des cellules cibles, et les cellules effectrices (lymphocytes receveurs ou lymphocytes allogéniques).

Les cellules effectrices dans ce type d’interaction sont les cellules dites K situées dans le sang périphérique. Contrairement aux cellules tueuses de la LMC, elles exercent un effet cytotoxique sans sensibilisation préalable, mais la manifestation action cytotoxique La production de cellules K n’est possible que grâce à des anticorps dirigés contre les déterminants des cellules cibles. La lyse spécifique est mesurée par la libération de 51 Cr si le sérum à tester contient des anticorps dirigés contre les déterminants cibles.

Les déterminants cibles dans l'ADCC peuvent être pratiquement les spécificités de tous les locus HLA, y compris HLA-D, HLA-DR, ainsi que les déterminants situés en dehors du système HLA.

Cette réaction complexe est la plus répandue dans la surveillance immunologique pour détecter les anticorps anti-cellules B. A cet égard, plusieurs modifications ont été proposées, prévoyant l'enrichissement de la suspension de cellules cibles en lymphocytes B, l'adsorption du sérum sur les plaquettes, etc.

De plus, un certain nombre d'autres fonctionnalités de réponse de ce système sont prises en compte. Le sérum à tester doit être décomplémenté, sinon la réaction pourrait être une cytotoxicité dépendante du complément médiée par les anticorps. Il est également supposé que les cellules effectrices peuvent provoquer une certaine destruction des cibles selon le type de CML.

En fin de compte, l’ensemble des échantillons du test de lymphocytotoxicité à médiation cellulaire dépendant des anticorps est le suivant :

Cibles + effecteurs + sérum test (échantillon expérimental) ;

Cibles (échantillon témoin, c'est-à-dire libération spontanée de 51 Cr) ;

Cibles + effecteurs (test de contrôle de l'activité effectrice) ;

Cibles + sérum test (sérum contrôle).

Les lymphocytes ont été isolés systématiquement et remis en suspension dans du RPMI-1640 + 10 % de sérum bovin fœtal ; traiter la suspension avec du fer carbonyle pour éliminer les monocytes ; ajoutez du chlorure d'ammonium ou H 2 O pour lyser les globules rouges restants ;

51 Cr sous la forme d'une solution de Na 2 CrO 4 100 - 200 µCi ml (3,7 x 10 6 - 7,4 x 106 BC/ml) est ajouté à la suspension de cellules cibles et incubé pendant 40 à 60 minutes ;

Les cellules sont lavées trois fois dans RPMI + 0,1% HSA, remises en suspension dans le même milieu et ajustées à 2x10 8 dans 1 ml ; 50 µl d'une suspension de cellules marquées sont placés dans un tube à essai et l'activité isotopique est ensuite calculée sur un compteur γ pour identifier une « assimilation » isotopique complète ; le reste est versé dans les puits de la plaque, 50 µl de suspension (1x10 5 cellules par puits) ;

La suspension de cellules effectrices est portée à 2x10 7 cellules dans 1 ml et c. chaque puits est rempli de 50 µl de suspension (ou 100 µl), le rapport effecteurs/cibles est de 10 :1 (ou 20 :1) ;

L'incubation se poursuit pendant 4 heures dans une atmosphère thermostatée humide avec 5 % de CO 2 (la durée d'incubation peut être prolongée jusqu'à 8 heures) ;

Préparez plusieurs dilutions du sérum à tester dans des tubes à essai (1:25 ; 1:100) et ajoutez jusqu'à 50 µl de chaque dilution dans les puits : et du sérum non dilué ; la configuration de test finale ressemble à celle indiquée dans le tableau. 23.

Tableau 23

Mise en scène ADCC. Toutes les options d'échantillon, µl

* (Au lieu du sérum test, un pool de sérums AB est instillé.)

** (A la place du sérum test, un sérum HLA monospécifique dirigé contre des cibles (et non des effecteurs) est instillé.)

L'incubation des panneaux se poursuit pendant 4 heures en atmosphère humidifiée avec 4% de CO 2 ; la durée d'incubation peut être prolongée jusqu'à 8 heures ;

Après incubation, la moitié du volume de chaque puits (100 µl) est soigneusement aspirée avec une pipette automatique et placée dans des tubes de comptage d'impulsions de 51 Cr ; l'activité est comptée sur un compteur γ ;

Les calculs sont les suivants :

% de libération de 51 Cr = 2 × A op - activité de fond/B - activité de fond × 100 ;

% de cytotoxicité = A op - A sp /100 - A sp × 100, où A op est le % de libération de 51 Cr dans les échantillons expérimentaux ; A sp - % de libération spontanée ; B - assimilation complète de l'isotope.

Comment résultat positif Une cytotoxicité de 5 % ou plus est considérée après 4 heures d’incubation.

Restrictions d'âge pour chaque test (existe-t-il des valeurs de référence pour les enfants ou les personnes de plus d'un certain âge - par exemple : pour le test 191, il n'y a pas de valeurs de référence pour les personnes de plus de 80 ans).

Lors de l'émission d'une réponse, le formulaire contient des valeurs de référence correspondant au sexe et à l'âge précisés du patient.

INVITRO dispose pour certains tests restrictions d'âge(puisqu'il n'existe pas de valeurs de référence pour un âge précis), le cabinet médical doit en avertir. Les restrictions touchent le plus souvent les enfants plus jeune âge. Des études fiables permettant de développer des valeurs de référence pour les enfants de cet âge peuvent ne pas être disponibles, et de nombreux indicateurs à cet âge sont très différents des valeurs attendues chez les adultes (les enfants ne sont pas de petits adultes).

Quant aux personnes de plus de 80 ans, s'il n'existe pas de valeurs de référence établies spécifiquement pour ce groupe, elles peuvent, avec une certaine prudence, utiliser les valeurs de référence obtenues pour le plus proche tranche d'âge d'autres adultes.

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Pas vraiment

Pourquoi certains tests ont-ils été effectués en hémolyse ? Pourquoi tous les tests ne sont-ils pas effectués lorsque l’échantillon est hémolysé ?

L'hémolyse a différents effets sur différents tests, par conséquent, les résultats des tests susceptibles d'être faussés par l'hémolyse ne sont pas délivrés. Au contraire, si son influence sur le test est insignifiante ou absente, les résultats sont communiqués au patient.

L'hémolyse est la destruction des cellules sanguines avec libération de leur contenu dans fluide extra cellulaire(par exemple, sérum, plasma). Cela peut être dû à la fois à des processus se produisant dans le corps du patient et à une violation de la technologie de collecte, de transport et de traitement des tubes sanguins.

Les substances libérées par les cellules détruites peuvent modifier considérablement les résultats de certains tests, à la fois en raison de impact direct aux étapes de l'analyse et en augmentant la teneur quantitative de la substance à déterminer. L'effet de l'hémolyse sur les résultats de l'analyse varie en fonction du test, de l'instrument, de la technique et de l'intensité de l'hémolyse elle-même.

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Pas vraiment

Pourquoi les résultats des différents laboratoires ne sont-ils pas les mêmes ?

Les résultats des mêmes tests effectués dans différents laboratoires diffèrent dans la plupart des cas. La raison en est les caractéristiques individuelles du patient, conditions différentes prise du biomatériau, méthodes de réalisation du test et délivrance du résultat.
Le premier facteur qui influence les résultats est l’erreur de mesure. Il s’agit là d’une déviation naturelle inévitable des résultats de la recherche par rapport à indicateurs idéauxà toutes les étapes.

Biologique est la fluctuation naturelle de la quantité de substance d'essai en fonction de caractéristiques individuelles le corps du patient, les facteurs environnementaux, les facteurs thérapeutiques et les conditions de prélèvement du biomatériau. Compte tenu du décalage horaire entre les deux procédures de prélèvement du biomatériau, ainsi que de ce qui se passait à ce moment-là, les conditions de préparation à l'analyse auraient pu changer, état physique Chez le patient, le contenu de certaines substances est soumis aux rythmes quotidiens, les substances sont particulièrement susceptibles de changer si le processus thérapeutique était en cours à ce moment-là.

Analytique – fluctuations des paramètres mesurés selon les lois de la physique et de la chimie auxquelles les équipements et les réactifs sont soumis. Compte tenu des fonctionnalités processus de laboratoire même en examinant deux échantillons du même échantillon en même temps, nous n'obtiendrons pas absolument valeurs identiques des mesures.

Le deuxième facteur lui-même test de laboratoire est un processus complexe en plusieurs étapes, dont chaque étape est constituée de 5 éléments qui évoluent dans le temps et d'un laboratoire à l'autre :

1. Biomatériau, ses propriétés, conditions de livraison, de stockage et de transformation.
2. Personnel, ses qualifications et ses actions.
3. Instruments, analyseurs, réactifs.
4. Modalités d'organisation du travail.
5. Système de contrôle qualité.

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Pas vraiment

Quelle est la fiabilité des résultats de la recherche ?

Les résultats des analyses effectuées par Invitro correspondent normes internationales qualité et jugé fiable.

La fiabilité des résultats des tests est un terme qui caractérise la proximité du résultat obtenu avec le contenu réel d'une substance dans le biomatériau étudié. La fiabilité des résultats d’analyse fait partie du concept de qualité et comprend de nombreux éléments.
La plus grande contribution à la fiabilité du résultat est apportée par la préparation de l'étude, ainsi que par la manipulation correcte de l'échantillon de sang : à ce stade, jusqu'à 62 % de toutes les erreurs peuvent survenir. La confirmation, la délivrance et l'interprétation du résultat par le médecin traitant peuvent être à l'origine de 23 % des erreurs.

Un laboratoire moderne ne peut être à l'origine que de 15 % du nombre total d'erreurs possibles, et ce chiffre dépend de la cohérence du laboratoire, de ses équipements et des critères de qualité établis.

Invitro est la plus grande entreprise médicale privée de Russie et son seul souci est la qualité. place importante. Dans Invitro, toutes les étapes de l'analyse sont sous contrôle - de la prise du biomatériau à la délivrance du résultat : le travail cabinets médicaux, service de messagerie, laboratoire - tout est soumis aux mêmes règles, ce qu'on appelle. des procédures opérationnelles standard, où chaque étape est décrite de manière très détaillée afin d'éliminer d'éventuelles erreurs.

En plus du contrôle qualité interne multi-niveaux, le laboratoire Invitro accepte Participation active sur plusieurs systèmes évaluation externe qualité en comparant vos résultats avec ceux d’autres laboratoires. En 2016, Invitro a confirmé la qualité des services de laboratoire au niveau international - dans le cadre du programme Six Sigma de Westgard QC. Selon les conclusions du programme, le nombre d’erreurs possibles dans le travail du laboratoire ne dépasse pas 3,4 pour 1 000 000 de cas.

L'importance de tout ce travail minutieux dans notre pays a été reconnue par la remise du Prix du Gouvernement russe dans le domaine de la qualité en novembre 2017.

SCL = culture lymphocytaire mixte = MLC = culture lymphocytaire mixte. Ce test consiste en un ensemble de cultures qui déterminent le degré avec lequel les conjoints reconnaissent les antigènes d'histocompatibilité de chacun. Lymphocyte - cellule centrale système immunitaire.Qu'est-ce que SKL ?I. I. Guzov, Ph.D., Ch. médecin au Centre d'Immunologie et de Reproduction SCL = culture lymphocytaire mixte = MLC = culture lymphocytaire mixte. Ce test consiste en un ensemble de cultures qui déterminent le degré avec lequel les conjoints reconnaissent les antigènes d'histocompatibilité de chacun. Le lymphocyte est la cellule centrale du système immunitaire . Le système lymphocytaire peut être comparé à un état où il y a des patrons et des subordonnés, et où chaque employé remplit une fonction spécialisée. Si un lymphocyte rencontre des objets étrangers au corps (bactéries, virus, cellules étrangères, etc.), alors une réponse immunitaire se produit. se développe. Si nous parlons de concernant les tissus ou cellules étrangers, le degré de la réponse immunitaire dépendra de la similitude de la configuration des antigènes d'histocompatibilité (HLA, antigènes leucocytaires humains, ou MHC, complexe majeur d'histocompatibilité, (ce sont des synonymes) antigènes). La réponse immunitaire s'exprime (apparition de clones (descendants d'une cellule) (cellules strictement spécialisées à des facteurs étrangers spécifiques). Autrement dit, si cellules immunitaires ils commencent à réagir à quelque chose, ils commencent à partager. Et la division cellulaire peut être évaluée par le taux de synthèse de l’ADN. Plus l’ADN est synthétisé, plus les cellules se divisent et plus la réponse immunitaire se développe activement. Le degré de synthèse de l'ADN peut être déterminé par l'inclusion dans la culture cellulaire du nucléotide radioactif thymidine - la « pierre angulaire » de l'ADN. L'évaluation d'une culture mixte de lymphocytes repose sur ce principe. de la manière suivante. Le sang est prélevé sur les époux, à partir duquel les lymphocytes sont isolés. Ces lymphocytes sont placés dans un milieu nutritif favorable à la division. Si vous mélangez des lymphocytes personnes différentes, ils commenceront à réagir les uns aux autres. Cependant, si vous enregistrez simplement l'activité d'une culture mixte de différentes personnes, il est impossible de comprendre comment une personne spécifique réagit, car les cellules de tous les participants à la culture mixte « entrent en bataille ». Afin d'évaluer la réaction individuelle de chaque participant à la culture, les cellules de l'un des époux sont exposées à une influence qui rend la division cellulaire impossible. Cependant propriétés antigéniques les lymphocytes sont préservés. Dans une telle culture, toute activité cellulaire sera associée uniquement aux cellules vivantes de l’autre conjoint. En comparant différentes combinaisons de cultures cellulaires vivantes et inactivées, on peut obtenir une information important sur le degré de similitude immunologique des époux. En fait, dans cette analyse, qui demande beaucoup de travail, 12 cultures différentes sont testées et la réaction est évaluée aux 3ème et 5ème jours de culture. Les 24 chiffres résultants permettent nous pour obtenir des informations importantes sur la façon dont une femme réagira aux antigènes de compatibilité tissulaire du mari pendant la grossesse. Le fait est que le maintien de la grossesse est processus actif. Tout comme pour la réaction de rejet, pour le développement tolérance immunologique Dans un premier temps, une reconnaissance immunologique adéquate de l’étranger est importante. Si cette reconnaissance est lente, ou si elle intervient trop tard, l'embryon est attaqué par les cellules tueuses naturelles de la mère et meurt. SCL permet non seulement d'évaluer l'état de reconnaissance immunologique des lymphocytes des époux entre eux, mais aussi de contrôler le processus de traitement utilisant la vaccination avec des lymphocytes, pour choisir la méthode et la dose de vaccination, évaluer les perspectives d'utilisation de l'une ou l'autre méthode de correction. Par conséquent, lorsqu'une « mauvaise » configuration des nombres dans le SCL est détectée, il est souvent nécessaire de répéter L'utilisation du SCL, qui a débuté dans notre centre au printemps 2000, a considérablement amélioré la qualité du traitement des patientes souffrant d'infertilité, de fausse couche et de tentatives de FIV infructueuses.

Les premiers rapports de culture lymphocytaire mixte (MLC) sont apparus en 1964 en lien avec le phénomène de transformation blastique. L'étude du SCL repose sur le même principe que la réaction de transformation blastique des lymphocytes (voir rubrique « Réaction de transformation blastique des lymphocytes »). La force de la réaction dépend du degré de différence entre les antigènes d'histocompatibilité. Les antigènes HLA-A, -B-B- et -C à la surface des lymphocytes correspondent aux antigènes HLA-D, qui ne peuvent être détectés que par SCL. Parallèlement, les antigènes DR (liés à D) peuvent être détectés à l'aide d'antisérums (voir rubrique « Cytotoxicité dépendante du complément. Typage HLA-DR. »). L'hypothèse selon laquelle les sérums anti-DR permettraient un typage fin de l'ensemble du locus D apparaît actuellement moins probable que l'hypothèse selon laquelle il existerait deux loci distincts.

Chromosome 6 humain avec le complexe HLA et les locus rapprochés (GLO ; PGM 3).

Actuellement, l’existence de 12 antigènes DW et de 10 antigènes OR a été précisément établie. LD - 2 = locus D mineur, dont l'existence peut être supposée sur la base d'une analyse de recombinaison

Même pour les antigènes Ia humains, un modèle à trois locus est actuellement en discussion, de sorte que le terme « DR » ne devrait plus être utilisé comme synonyme de « molécules humaines de classe II ».

Pour évaluer la réactivité (d'un individu) à un stimulus allogénique, un SCL dit unidirectionnel est préparé, dans lequel des cellules inactivées sont utilisées pour la stimulation. Il convient de noter que même les cellules stimulantes inactivées (voir ci-dessous) ont la capacité de sécréter des facteurs mitogènes et, dans une certaine mesure, d'améliorer la synthèse de l'ADN et la biosynthèse des immunoglobulines. Cela peut devenir une source cachée d’erreurs. Les interactions qui se produisent au cours de la réaction allogénique ont été bien étudiées dans le modèle murin.

Mécanisme d'induction d'une réaction allogénique pour obtenir l'effet de lymphocytolyse cellulaire dépendante (modification décrite dans l'ouvrage correspondant)

MF-macrophages ; TlNDH - inducteur de cellules auxiliaires ; Tn - T-assistant ; рТ с - précurseur d'une cellule cytotoxique ; Tc - cellule cytotoxique ; triangle - antigène DR ; rectangle - Antigènes HLA-A/B

Cependant, on ne sait toujours pas quels types de cellules sont impliqués dans la réponse proliférative. L'étude de la réaction primaire des lymphocytes face aux cellules allogéniques est utilisée dans les cas suivants :

Tester la réactivité du SCL comme critère d'évaluation de l'immunité cellulaire ;

Typage HLA-D ;

Clarification de la relation entre les antigènes HLA-D et la prédisposition à certaines maladies ;

Sélection d'un couple donneur-bénéficiaire.

Une grande attention est actuellement accordée à la recherche sur le rôle mécanismes immunitaires dans le processus de reproduction, puisque leur violation conduit au développement de l'infertilité et interruption anticipée grossesse. Recherche paramètres immunologiques et leur relation avec les processus de reproduction nous a permis de conclure qu’il est nécessaire de reconstruire le système immunitaire lors de la préparation du corps de la mère à la grossesse, en commençant par période ovulatoire, au moment de l'implantation de l'embryon et dans période au début grossesse.

L’une des causes d’infertilité et de fausses couches spontanées à répétition les plus complexes et les plus difficiles à diagnostiquer est le dysfonctionnement immunitaire.

Dans le but de détection rapide infertilité immunologique au laboratoire d'immunologie de la reproduction, un examen des couples mariés est réalisé à l'aide méthodes suivantes Diagnostique:

• étude du niveau de réponse proliférative des lymphocytes d’une femme aux antigènes du partenaire (en culture mixte de lymphocytes)
• détermination de l’activité des facteurs bloquants dans le sérum sanguin d’une femme.
• évaluation du contenu quantitatif des sous-populations de cellules cytotoxiques naturelles dans le sang périphérique d’une femme.
• immunogramme étendu
• étude du contenu des cellules régulatrices à activité suppressive dans le sang périphérique.
• lors de l’identification des symptômes cliniques et signes de laboratoire Il est recommandé de procéder à un examen immunologique des patients atteints d'infertilité. procédure médicale– l'allo-immunisation avec les lymphocytes du mari, qui est réalisée selon un calendrier individuel.

Consultation requise :

• si en l'absence de contrôle gynécologique et maladies endocriniennes Avec une activité sexuelle régulière pendant un an, il n'y a pas de grossesse.
• en cas d'interruptions spontanées répétées (plus d'une fois) de grossesse (fausse couche).
• à FIV infructueuse dans l'anamnèse.
• lorsqu'il existe une menace d'interruption d'une grossesse réelle.

Si des troubles sont détectés, une procédure est prescrite dans le but d'immunocorrection des troubles allo-immunisation avec lymphocytes partenaires (AIL). Cette méthode traitement approuvé pour utilisation Service fédéral pour l'encadrement dans le domaine de la santé (licence FS n° 2009/179 du 02/07/2009)

La procédure n'est effectuée que si le partenaire a résultats négatifs analyse de l'infection par le VIH, de la syphilis et hépatite virale(AVANT JC). Aucune complication n’a été identifiée avec l’AIL. La méthode AIL a un effet immunocorrecteur prononcé, augmente l'efficacité du traitement de l'infertilité, à la fois dans le cycle naturel et avec la fécondation in vitro(ÉCO). Également prescrit pour tentatives infructueuses la fécondation in vitro.

L'AIL est effectuée une fois tous les 28 à 30 jours (conformément à cycle menstruel femmes) en 1ère phase du cycle. Le premier cours comprend 3 procédures AIL. Après la 2ème procédure, le couple passe à nouveau un test de contrôle. S'il y a une dynamique positive, la troisième procédure AIL est la dernière. S'il n'y a pas de dynamique, la dose de cellules pour l'immunisation est augmentée et une 2ème cure est réalisée, comprenant 2 procédures. Après une analyse de contrôle, dans certains cas il est nécessaire de prescrire une 3ème cure de vaccination avec augmentation de la dose de cellules. Après avoir atteint les valeurs standards, l’effet positif dure 6 à 8 mois.

Pour la période de 2003 à 2013. Au laboratoire d'immunothérapie cellulaire, environ 3000 procédures d'allo-immunisation avec des lymphocytes partenaires ont été réalisées. Pour cette procédure, seuls les lymphocytes sont isolés du sang du partenaire, qui sont toujours présents dans le liquide sperme. Dans d'autres pays*, la procédure d'allo-immunisation est également pratiquée depuis 20 ans, ce qui permet à une femme de porter et de donner naissance à un enfant en bonne santé.